modellen for insulinsignaleringsvej
ud fra tre offentliggjorte modeller implementerede vi modellen for internetudbyder som afbildet i Fig. 1 brug af Systembiologi grafisk Notation .
modellen for insulinsignaleringsvej. Modellen af Insulin signalvej opnået ved at integrere PI3K-AKT vej, mTOR vej og Ras-MAPK vej, afbildet ved hjælp af Systembiologi grafisk Notation. Farvede noder ligner klyngeresultaterne opnået på simulerede profiler (Se Fig. 3 ). Farvede linjer repræsenterer vigtige feedbackmekanismer; nemlig: den røde linje repræsenterer p70s6k-IRS1 negativ feedback loop, den blå linje ERK1 / 2-GRB2 / SOS negativ feedback loop
modellen omfatter mange af de væsentlige elementer, der er ansvarlige for insulinvirkningen, da de tre vigtigste underveje for internetudbyderen, kort beskrevet i det følgende, er inkluderet.
PI3K-AKT-stien
for PI3K-Akt-stien henviser vi mest til modellen i Sedaghat et al. . Modellen er blevet brugt af flere forskningsgrupper og inkluderer mange af de mest kendte signalkomponenter, der formidler translokationen af glukosetransportør GLUT4. Disse omfatter insulinreceptorbindings-og genbrugsundersystemerne; postreceptorsignaleringsundersystemet, herunder både Ser – og Tyr – phosphorylering ved insulinreceptorsubstrate1 (IRS1); dannelse af et kompleks (IRS1_PI3K-kompleks) mellem phosphoryleret IRS1 og phosphatidylinositid 3-kinase (PI3K); phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphater PI (3,4,5) P3, syntese; fosforylering af protein kinase B (AKT) og protein kinase C (PKC)-ζ; den balancerede translokation af GLUT4 til plasma membranen. Protein tyrosinphosphatase (PTP1B) og lipidphosphataser (SHIP2 og PTEN) effekter overvejes også i modellen.
TSC1/2-mTOR-stien
for TSC1/2-mTOR-stien henviser vi mest til den model, der for nylig blev offentliggjort i Sonntag et al. , der beskriver mTOR-effekten som reaktion på insulin og aminosyrer. Modellen betragter både mTOR-komplekser: mTORC1 og mTORC2. mtorc1-aktivering er afhængig af tilstedeværelsen af aminosyrer og hæmmes af tuberøs sklerose proteiner 1 og 2 (TSC1/2) Aktivering (dvs.Ser phosphorylering), som igen afhænger af 5′ AMP-aktiveret proteinkinase (AMPK) aktivering. AMPK-aktivering afhænger af IRS1 Tyr-phosphorylering, hvorimod TSC1 / 2-hæmning (dvs.Tyr-phosphorylering) afhænger af AKT-phosphorylering ved Thr309. mTORC2, som for nylig blev identificeret som den ukendte phosphoinositidafhængige proteinkinase 2 (PDK2), dvs. den kinase , der er ansvarlig for ser474-phosphorylering af AKT, bidrager til den dobbelte phosphorylering af AKT sammen med Thr309-phosphorylering, der drives af den phosphoinositidafhængige proteinkinase 1 (PDK1). Sonntag et al. formuler hypotesen om tilstedeværelsen af en PI3K-variant, som er direkte reguleret af den aktiverede insulinreceptor og aktiverer igen mTORC2. Vi inkluderede denne hypotese i vores model.
RAS-MAPK-stien
for RAS-MAPK-stien henviser vi mest til modellen i Borisov et al. , der beskriver både EGF og insulinstimuleringer. Modellen inkluderer alle de vigtigste kemiske mekanismer, der er involveret i Ras-MAPK-vejen: interaktionen mellem Tyr-phosphoryleret IRS1 med SHP2 (det SH2-domæneholdige tyrosinproteinkinase 2) og GRB2-SOS-kompleks (vækstfaktorreceptorbundet 2 og son of sevenless – komplekset), hvorved der dannes henholdsvis SHP2-IRS1 og GRB2/SOS-IRS1-komplekserne; GTP-bindingen af RAS; phosphoryleringen af RAF proto-oncogen serin/threonin-proteinkinase (C-RAF); interaktionen mellem insulinreceptor og Ras GTPase-aktiverende protein (RASGAP), som igen katalyserer den omvendte proces med RAS-deaktivering; aktiveringen af proto-onkogen-tyrosin-proteinkinase SRC, som fuldt ud aktiverer c-RAF; den dobbelte specificitet mitogenaktiveret kinase 1/2 (MEK1/2); de ekstracellulære signalregulerede kinaser (ERK1/2).
Integration af PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR og RAS-MAPK-stierne
PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR og RAS-MAPK-stierne indeholder flere overlappende dele, som i de originale papirer ofte blev modelleret på forskellige måder baseret på lidt forskellige antagelser. Vi sammenlignede de overlappende reaktioner på tværs af forskellige modeller og implementerede den mest opdaterede version af dem baseret på den nuværende viden om cellulær biokemi. Desuden kræves integrationen af de tre modeller, der beskæftiger sig med de forskellige måleenheder, der er vedtaget for at beskrive tilstandsvariablerne. Mens immunoblot-eksperimenter tillader at få vigtig information om tidsskalaen for signalhændelser, kvantitativ information om proteinekspression er ofte problematisk at hente, så de forudsagte koncentrationsprofiler undertiden rapporteres i mikromolær koncentration, som i Borisov et al. , eller i vilkårlige enheder (AU), som i Sonntag et al. . I modsætning hertil i Sedaghat et al. udtrykt enten i molære enheder eller i procent af den totale koncentration (f.eks. blev GLUT4-cytosolkoncentrationen anset for at være 96% af den totale GLUT4-koncentration i cellen ved baseline-tilstand).
potentielt tillader RBM at udføre både deterministiske og stokastiske simuleringer, forudsat at variable mængder udtrykkes i kopier af molekyler pr. Selvom vi i det nuværende arbejde ikke brugte stokastisk simulering, justerede vi alle variablerne til den samme enhed, dvs. celler ved at multiplicere de molære enheder med NA*V (NA angiver Avogadro nummer og v cellevolumen, betragtes som lig med 3e-12 l). Alle detaljer om enhedskonvertering fra AU og procentvise koncentrationer er angivet i materiale og metoder.
den resulterende model består af 42 reaktionsregler og 101 parametre, der koder for interaktionerne mellem 61 forskellige kemiske arter. Reaktioner, parameterværdier og indledende betingelser er alle rapporteret i den ekstra fil 1.
nyheder af RBM-ISP-modellen
RBM-implementeringen Letter regnskab for et antal af ISP-funktionerne, såsom phosphorylering af signalproteiner på flere steder og med flere effekter, samtidig interaktion mellem molekyler med forskellige bindingspartnere og den subcellulære lokalisering af nogle reaktioner. Ovennævnte egenskaber diskuteres i detaljer i det følgende.
phosphorylering af signalproteiner på flere steder
signalmolekyler kan have forskellige aktivitetsniveauer, afhængigt af hvilke rester der phosphoryleres. Overvej for eksempel IRS1 og AKT. IRS1 har mange rester, der potentielt er involveret i posttranslationelle modifikationer og kan aktiveres eller hæmmes i sin kinasevirkning, afhængigt af at den phosphorylerede Rest er Tyr eller Ser . For eksempel kræves Tyr-896-phosphorylering til PI3K -, SHP2-og GRB2-binding, mens Ser-636-phosphorylering ved p70S6K er en mekanisme relateret til insulinresistens . AKT kan derimod aktiveres ved phosphorylering ved henholdsvis Thr309 eller Ser474 ved henholdsvis pdk1 og mTORC2 .
IRS1 phosphoryleringsafhængig aktivering/inhibering var allerede inkluderet i Sedeghat-modellen, selvom man overvejede Ser-phosphorylering reguleret af PKC og ikke af p70S6K, som i Sonntag-modellen. Her modellerede vi både PKC og p70S6K handlinger og beskrev pIRS1-Tyr896 kompleks dannelse / dissociation med PI3K , SHP2 og GRB2 .
de to phosphoryleringssteder for AKT blev ikke eksplicit modelleret i Sedaghat et al. . Vi modellerede AKT-phosphoryleringen ved Thr medieret af PI(3,4,5)P3 som i Sedaghat et al. Act phosphorylering ved Ser medieret af mTORC2 som i Sonntag et al. model og antaget:
- i)
AKT phosphoryleret enten på Thr eller begge steder for at virke på TSC1 / 2-komplekset ved at formidle dets phosphorylering ved Tyr og dephosphorylering ved Ser ;
- ii)
AKT-phosphorylering ved Ser eller begge steder for at inaktivere C-RAF ;
- iii)
AKT-phosphorylering ved enten Thr eller Ser for at aktivere GLUT4-translokation .
interaktion med multiple bindingspartnere
interaktionen mellem molekylerne i signalvejene med adskillige forskellige bindingspartnere resulterer i den potentielle dannelse af forskellige komplekser. I ISP kan IRS1 phosphoryleret ved Tyr – 896 binde PI3K som modelleret i Sedaghat et al. eller GRB2 / SOS og SHP2, som modelleret i Borisov et al. . For at matche RBM-ISP-modelspecifikationen med den nuværende viden tillod vi dannelsen af forskellige komplekser. Således kan IRS1 binde på en gensidigt eksklusiv måde GRB2/SOS og SHP2, men kan binde samtidigt GRB2/SOS og P85 regulerende underenhed af PI3K .
oplysninger om subcellulær lokalisering i reaktionsregler
muligheden for, at proteiner skal interagere, er ofte relateret til deres fysiske lokalisering, dvs.deres tilstedeværelse i det ekstracellulære rum, cytoplasma, kerne, plasmamembran osv. For eksempel fungerer lipider PI(3,4,5)P3 som docking-steder i plasmamembranen, der rekrutterer forskellige proteiner, der indeholder pleckstrin-homologidomæner (PH) (f. eks. AKT og PDK1) og deres Co-lokalisering kan fremskynde specifikke signalhændelser . Et andet eksempel er interaktionen mellem mTORC1 og Ras-homologen beriget i hjerne (RHEB) og Rag-familie på lysosommembran, rapporteret af Soncu et al. . I vores model inkluderede vi oplysningerne om subcellulær lokalisering for insulinreceptoren og GLUT4-transportøren, der skelner mellem deres plasmatiske og cytoplasmatiske lokalisering i henhold til den matematiske beskrivelse givet af Sedaghat et al. .
model forudsigelser
koncentrationsprofilerne for alle de kemiske arter, der befolker modellen, blev simuleret efter 60 min, 100 nM insulinstimulering. Koncentrationen på 100 nM repræsenterer et godt accepteret niveau af insulinstimulering i cellekulturer, der almindeligvis findes i litteraturen og også anvendes af vores gruppe . Ifølge Sonntag et al. , antog vi også en konstant aminosyrestimulering, der var nødvendig for at opnå mtorc1-aktiveringen og feedback af p70S6K på IRS1. For at vurdere modelens pålidelighed blev modelforudsigelser sammenlignet med eksperimentelle data tilgængelige i vores datasæt for nogle phosphoproteiner på tidspunktet 2, 5, 10, 30 og 60 minutter efter insulin plus aminosyrer, dvs .leucin, stimulering. Som vist i Fig. 2 er de eksperimentelle og forudsagte profiler af pAKT-s473 og pmTORC1-s2448 i god overensstemmelse, da de begge viser et stigende fosforyleringsmønster, der når en stabil tilstand i henholdsvis de første 2-5 minutter og 20-30 minutter. Den forudsagte profil for ppERK1 / 2-Y202,Y204 bekræftes af eksperimentelle data i de første 10 minutter, mens det i de sidste tidspunkter falder hurtigt i eksperimentelle data med hensyn til modelforudsigelser. Profilen observeret i eksperimentelle data for ppERK1/2-Y202,Y204, kan være tættere matchet ved at øge styrken af feedbacken mellem ppERK1/2-Y202,Y204 og GRB2/SOS. I Fig. 2 (øverste højre panel, stiplet linje), den simulerede profil af ppERK1/2-Y202, Y204 opnået ved at multiplicere parameteren kcat39 (se yderligere fil 1) med en faktor på 10 vises. Bemærk, at I RBM ISP-modellen, der er tilgængelig online , besluttede vi at lade parameteren for modellen være uændret, dvs.vi bruger værdien fra litteraturen og udsætter parameteroptimering til fremtidige undersøgelser, når yderligere data vil være tilgængelige. Desværre var de eksperimentelle data fra pP70S6K-T389 ikke pålidelige (kun en replikat tilgængelig), så vi kan ikke sammenligne de eksperimentelle og simulerede profiler for dette protein, som er et slutpunkt for vejen med en vigtig feedbackhandling på IRS1. Ikke desto mindre er den simulerede profil vist i Fig. 2 (nederste, højre panel) ligner eksperimentelle data vist i andre papirer .
sammenligning mellem simulerede og eksperimentelle data. Sammenligning mellem eksperimentel koncentration (point) og normaliserede model forudsigelser (linjer) for pAkt-S473, ppERK1/2, pmTOR-S2448 og pP70S6K-T389. Profilen af ppERK1/2-Y202,Y204 opnået ved at øge styrken af feedbacken mellem ERK og GRB2 / SOS er vist i stiplede linjer. Værdier rapporteres for eksperimentelle data for humane skeletmuskelceller (Skmc ‘er) udsat for EBSS + 100 nM insulin ad gangen 0′, 2′, 5′, 10′, 30′, og 60’. Alle målinger blev taget i tre biologiske replikerede, og for hver biologiske replikater blev der foretaget tre tekniske replikerede målinger. Alle data er udtrykt i vilkårlige enheder (AU) og skaleres mellem 0 og 1 af hensyn til sammenligning
vi undersøgte de forudsagte profiler for alle de aktive arter og grupperede dem i fire klynger i henhold til deres dynamiske opførsel, som vist i Fig. 3:
klyngedannelse af simulerede profiler. Fire klynger blev identificeret for de forudsagte profiler for den aktive art, i henhold til deres dynamiske opførsel: 1) Hurtig respons, der når steady state inden for 2-5 min (blå); 2) hurtige overskridelsesresponser, der når et højdepunkt inden for 2-5 min og falder ned til en steady state efter 10-20 min (grøn); 3) langsom respons, der når steady state i 10-20 min (orange); 4) langsom overskridelse svar nå et højdepunkt i 5-10 min og faldende til en stabil tilstand i 30-60 min (lilla)
-
hurtig respons, når steady state inden for 2-5 min (blå)
-
hurtig overshooting respons, når toppen inden for 2-5 min og derefter steady state efter 10-20 min (grøn)
-
langsom respons, når steady state i 10-20 min (orange)
-
langsom overskridelse svar, når toppen i 5-10 min og steady state i 30-60 min (lilla).
efter insulinstimulering reagerer insulinreceptoren hurtigt ved phosphorylering og udløser en kaskade af hændelser langs forskellige veje. Langs PI3K-AKT-stien er alle mekanismer, der er tæt relateret til IRS1 Tyr – phosphorylering, kendetegnet ved en hurtig respons. Det samme gælder for andre direkte mål for IRS1-phosphoryleret ved Tyr langs TSC1/2-mTOR-kaskaden, dvs.AMPK-phosphorylering ved t172, SHP2-IRS1 og GRB2 / SOS-IRS1-kompleksdannelse. Det hurtige respons er kendetegnet ved enten en hurtig stigning til steady state eller ved en forbigående overskridelse efterfulgt af steady state-tilstanden afhængigt af fraværet/tilstedeværelsen af feedbackmekanismer, der virker på målmolekylet (sag 1 og 2, henholdsvis i blåt og grønt, i Fig. 3). Mekanismer, der for det meste udgør TSC1 / 2 – mTOR-stien og spiller en rolle i Ser-phosphorylering af IRS1, er kendetegnet ved et relativt langsomt ikke-overskridende respons (sag 3, orange i Fig. 3). Som observeret ovenfor antager Ras-MAPK-stien i sine opstrøms komponenter en hurtig reaktion, som bliver mærkbart langsommere for de nedstrøms (sag 4, Lilla i Fig. 3).
generelt er molekyler nedstrøms stien, relateret til relativt langsomme processer såsom transkriptionsaktivering eller interaktion med miljøet uden for cellen, såsom ERK1/2 og GLUT4, kendetegnet ved langsom respons, mens molekyler opstrøms stien er kendetegnet ved en hurtig respons for at fremkalde en hurtig signaludbredelse. I denne sammenhæng kan overskridelsesresponsen efterfulgt af tilbagevenden til en stabil tilstand bidrage til at opnå en hurtig signaludbredelse på en signalrute, hvilket gør molekyler igen tilgængelige for andre signalruter umiddelbart efter.
modelforudsigelser i fravær af kontrolmekanismer
et antal simuleringer blev derefter Udført for at undersøge systemets robusthed på to måleffekter af ISP: GLUT4-translokation og ERK1/2-phosphorylering. I særdeleshed, to vigtige kontrolmekanismers rolle i reguleringen af måleffekterne blev analyseret:
-
p70s6k-IRS1 negativ feedback loop (rød linje i Fig. 1);
-
ERK1 / 2-GRB2/SOS negativ feedback loop (blå linje i Fig. 1);
til dette formål blev tidsforløbet for GLUT4 og ERK1/2 respons i tilstedeværelse og fravær af de to reguleringsmekanismer, der er anført ovenfor, sammenlignet (Fig. 4). Dynamikken i dobbelt phosphoryleret ERK1/2 påvirkes stærkt af både p70s6k-IRS1 og ERK1/2-GRB2 / SOS negative feedback loops. På den anden side påvirkes steady state og dynamisk opførsel af GLUT4 i membranen ikke af ERK1/2, men påvirkes stærkt af p70s6k-IRS1 negativ feedback loop, hvilket bekræfter den bemærkelsesværdige Betydning af sidstnævnte kontrolmekanisme til bestemmelse af systemdynamikken.
simulerede ppERK1/2-T202-Y204 (øverste panel) og GLUT4 membrankoncentration (nederste panel) profiler ved 100 nM insulinstimulering med den komplette model (sort), modellen uden p70s6k-IRS1 feedback (rød) og modellen uden ERK1 / 2-GS feedback (blå). Sidstnævnte påvirker ikke GLUT4 membrankoncentration; derfor er GLUT4 simulerede profiler med og uden ERK1/2-GS feedback overlejret
det er velkendt, at insulinresistens er forbundet med defekter i IRS-afhængig signalering, hvilket implicerer dets dysregulering i initiering og progression af metabolisk sygdom. En ny opfattelse er , at den positive/negative regulering af IRS ved autologe veje er undergravet i sygdom ved øget basal og andre midlertidigt upassende serin/threonin phosphoryleringer, hvilket fører til en reduceret glukoseoptagelse. Kompenserende hyperinsulinæmi kan stige på dette tidspunkt og i sidste ende føre til diabetes. Selvom IRS1 (og IRS2) er reguleret gennem en kompleks mekanisme, der involverer phosphorylering af mere end 50 forskellige serin/threonin rester, i vores model p70s6k-IRS1 negativ feedback loop synes afgørende for en god kontrol af glukoseoptagelse. Forbedring af p70s6k-IRS1 negativ feedback loop er i stand til at forklare en reduceret insulinfølsomhed og glukoseoptagelse (Fig. 5). Tilsvarende (selvom de også antager en positiv feedback fra mTOR til en anden IRS1-Serinrest), br Larsnnmark et al. , ved hjælp af en minimal model for insulinsignalering, viser, at en nedsat positiv feedbackmekanisme er i stand til at forklare en reduceret glukoseoptagelse.
simuleret GLUT4-membrankoncentration ved 60 min ved forskellig insulinstimulering med den komplette model (sort), modellen uden p70s6k-IRS1-feedback (rød) og modellen med forbedret p70s6k-IRS1-feedback, opnået ved at øge parameter k15 med 100 % af dens vaue (grøn)
på den anden side synes både p70s6k-IRS1 og ERK1/2-GRB2/SOS negative feedbacksløjfer vigtige for at garantere, at dobbelt phosphoryleret Erk viser en forbigående opførsel med en top på 10 minutter efterfulgt af en tilbagevenden til baseline tilstand. Denne adfærd er allerede rapporteret i litteraturen under insulinstimulering og under epidermal vækstfaktorstimulering . Et forbigående Erk-respons forhindrer en vedvarende aktivering af erk, der ville resultere i kontinuerlig celleproliferation .
følsomhedsanalyse
for yderligere at undersøge rollen af de to store kontrolmekanismer til regulering af måleffekterne blev lokal følsomhedsanalyse udført ved at anvende en lille forstyrrelse (0.1% af parameterværdien) til en modelparameter ad gangen og evaluering af de resulterende relative ændringer af GLUT4-translokation og ERK1/2-phosphorylering (se metoder). Tabel 1 og 2 viser følsomhedskoefficienterne for modelparametrene, rangeret i overensstemmelse med deres absolutte værdi og sammenlignet med den værdi, som koefficienterne antager ved fjernelse af p70s6k-IRS1 og ERK1/2-GRB2/SOS negative feedbacksløjfer. Disse koefficienter måler den samlede effekt, dvs. under observationsvinduet, af en parameterændring på resultatet, dvs.GLUT4-og Erk-respons. Positive / negative værdier betyder, at forøgelse af parameterværdien har den virkning at forbedre/reducere responsen. Da små absolutte værdier betyder, at parameterændringerne ikke påvirker resultatet væsentligt, rapporteres i tabel 1 og 2 kun koefficient større end 0,1 % (absolut værdi), enten i den originale eller ændrede model.
parametrisk følsomhedsanalyse af den komplette model for GLUT4-respons afslører, at de mest følsomme parametre er relateret til GLUT4-translokation til plasmamembran efterfulgt af dem, der er relateret til lipiddannelse og IRS1_PI3K kompleks dannelse/dissociation. Fraværet af p70s6k_irs1 feedback har en stærk indflydelse på at øge følsomheden (absolut værdi) af parametre relateret til lipiddannelse og IRS1_PI3K kompleks dannelse/dissociation.
parametre relateret til baseline IRS1-phosphorylering/dephosphorylering ved Tyr/Ser har lavere følsomhed, hvilket generelt mindskes (absolut værdi) ved at fjerne p70s6k-IRS1-feedback, med undtagelse af parameter k7p, relateret til IRS1-phosphorylering ved Ser. Parametre relateret til PKC-medieret IRS1-phosphorylering ved Ser viser også øgede værdier efter fjernelse af p70s6k-IRS1-feedback. Da ERK1/2-GRB2 / SOS-feedbackfjernelse ikke har nogen effekt på GLUT4-translokation, ændres følsomhedskoefficienterne ikke med og uden denne feedback.
parametrisk følsomhedsanalyse af den komplette model for ERK1/2-respons viser, at de mest følsomme parametre er relateret til Ras -, MEK-og RAF-aktivering og til IRS1-phosphorylering ved Tyr og Ser, sidstnævnte medieret af p70S6K.langs både PI3K-AKT og RAS-ERK1/2-stien synes ERK1/2-GRB2/SOS-feedback at have en vigtig rolle for systemets robusthed. Systemdynamikken påvirkes svagt af dets fravær (se Fig. 4), mens parameterfølsomheden stiger (i absolut værdi) i næsten alle tilfælde, hvis denne feedback fjernes.
konklusioner om effekten af p70s6k-IRS1 feedback på ERK1/2 respons er mere kontroversielle. Fjernelse af denne feedback har den virkning at reducere parameterfølsomheden langs PI3K_AKT-stien, mens den langs Ras-ERK1/2-stien næsten ikke har nogen effekt for parametre relateret til MEK-phosphorylering, RAF-inaktivering og Erk-phosphorylering. Det mindsker følsomheden for parametre relateret til Ras, RAF-aktivering og IRS1-GRB2/SOS og IRS1-SHP2 kompleks forstyrrelse. Det øger kraftigt følsomheden af parametre relateret til SRC-og RAF-aktivering.
disse resultater fremhæver den centrale rolle, som negative feedbacksløjfer spiller for at bestemme ikke kun dynamikken i et biologisk system, men også dets robusthed. Denne egenskab er af bemærkelsesværdig betydning, fordi den bevarer systemets dynamiske opførsel mod støj og små biologiske udsving, der ofte skyldes intercellulær variabilitet.