Agentes metilantes de c
La sensibilidad cruzada de ciertas cepas de bacterias a la irradiación UV y al agente alquilante monofuncional MMS, a diferencia de los compuestos discutidos hasta ahora, no parece deberse a un reconocimiento similar de daño excitable por la misma endonucleasa que reconoce dímeros de timina en el ADN. La existencia de mutantes bacterianos sensibles al MMS es evidencia prima facie de la existencia de mecanismos de reparación en el tipo salvaje, pero ahora parece que no es una base alquilada per se la que se reconoce por un mecanismo de reparación, sino probablemente una ruptura de una sola hebra en el ADN. Después del tratamiento con MMS, B. subtilis fue inactivada por la formación de roturas de una sola hebra en el ADN, que, se demostró, B. subtilis de tipo salvaje puede reparar (Strauss y Wahl, 1964; Prakash y Strauss, 1970); sin embargo, un mutante sensible a MMS era deficiente o carecía de esta capacidad. Además, se argumentó que la sensibilidad cruzada observada a los rayos UV o X podría explicarse por la formación de roturas de una sola hebra que se sabe que forman estos últimos agentes.
La confirmación de este punto de vista se obtuvo a partir de las propiedades de un mutante de B. subtilis que era sensible a la irradiación UV pero no a MMS (Searashi y Strauss, 1965). Esa metilación de bases de ADN, en lugar de roturas de hebras inducidas por MMS, no evoca ninguna reparación de escisión en B. subtilis también quedó claramente demostrado por el hecho de que no se observó ninguna pérdida significativa de grupos metilo del ADN de células sensibles o de tipo silvestre durante varias generaciones celulares. Este hallazgo indicó la capacidad de las células para replicar el ADN metilado y es consistente con la capacidad replicativa del ADN modificado por arilalquilación (Venitt y Tarmy, 1972).
El estudio anterior sobre la reparación del daño por metilación inducida por MMS en B. por lo tanto, subtilis puede contrastarse con otros estudios sobre la reparación del daño por alquilación introducido por el agente metilante monofuncional MNNG (Lawley y Orr, 1970) en E. coli B/r. Difiere del MMS en producir una proporción apreciablemente mayor de residuos de O 6-metilguanina en el ADN alquilado. Este producto, así como la 3-metiladenina y posiblemente algunos productos no identificados (material de origen en cromatogramas de papel) parecen ser extirpados selectivamente en comparación con la pérdida de N −7-metilguanina del ADN de las células B/r de E. coli en condiciones que permiten el crecimiento y la síntesis de ADN. La 3-metiladenina y la O 6-metilguanina, pero no el material de origen, también se extirparon de las células Bs-1, pero posiblemente a una tasa reducida. Lawley y Orr no declararon si había o no diferencia en la supervivencia de las células B/r y Bs-1 tratadas con MNNG, lo que podría indicar que tales diferencias en la capacidad de escisión reflejan el funcionamiento de un mecanismo de reparación del ADN que ayuda a la supervivencia celular. Sin embargo, Kondo et al. (1970) no reportaron aumento de la letalidad o aumento de la frecuencia de mutaciones en E. coli, para cepas incapaces de extraer dímeros de pirimidina, después del tratamiento con MNNG, en comparación con MMS. Esto es a pesar del hecho de que la alquilación del ADN por MNNG produce 20 veces la cantidad de O 6-metilguanina que se produce por alquilación del ADN por MMS (Lawley et al., 1971–1972).
La evidencia de que esta «pérdida» de 3-metiladenina y O 6-metilguanina está mediada por un mecanismo de escisión enzimática, diferente de una endonucleasa UV, proviene de estudios in vitro sobre las propiedades de una enzima, denominada endonucleasa II, aislada de E. coli (Friedberg y Goldthwait, 1969). Esta enzima es capaz de romper enlaces fosfodiéster en el ADN que ha reaccionado con el agente alquilante MMS y de reconocer sitios depurados en el ADN. Más recientemente, se demostró que liberaba O 6-metilguanina y N 3-metiladenina, pero no N 7-metilguanina del ADN que había sido metilado por el carcinógeno MNU (Kirtikar y Goldthwait, 1974). La endonucleasa II, por lo tanto, posee claramente muchas funciones diferentes, una de las cuales parece capaz de cortar los enlaces glucosídicos unidos a ciertas purinas sustituidas. Por otro lado, podría ser una mezcla de enzimas. La existencia de una enzima que es igualmente capaz de llevar a cabo esta escisión postulada de enlaces N-glucosídicos (y por lo tanto llamada N-glucosidasa) se ha aislado recientemente de E. coli y se ha demostrado que libera uracilo libre de residuos de citosina desaminados que contienen ADN (Lindahl, 1974). El sitio depurado resultante puede ser reconocido y reparado por otro sistema enzimático asociado(cf. Verly y Paquette, 1972). La especificidad de un preparado de E. coli también se ha observado para la 3-alquiladenina, pero no para la 7-alquiladenina por Papirmeister et al. (1970). Se ha encontrado que los residuos de 3-etiladenina y O 6-etilguanina, pero no de N −7-etilguanina en el ADN formados por reacción de N-etil-N-nitrosourea, se extirparon de manera similar del ADN de E. coli WP2 (Lawley y Warren, 1975). Actualmente se ha observado la escisión de los productos menores de la alquilación de purinas en células de mamíferos in vivo y, además, la disminución de la capacidad de escisión en ciertos tejidos se ha correlacionado con la identidad del órgano diana de algunos carcinógenos alquilantes (véase más adelante la sección I,C, de la Parte B).
La aparente falta de reconocimiento y escisión de residuos de N 7-alquilguanina en el ADN por un mecanismo de reparación, como indican los estudios de Prakash y Strauss (1970) y de Lawley y Orr (1970), también fue evidente en los estudios de Kimball et al. (1971a) on the effects of MMS and MNNG in Haemophilus influenzae. Por lo tanto, es algo sorprendente que este mismo residuo parezca ser reconocido en Euglena gracilis. Tras la metilación con N-metil-N-nitroso-p-toluenosulfonato, la 7-metilguanina se perdió del ADN con una semivida de 10 horas (Olson y McCalla, 1969), que es considerablemente más corta que la semivida de aproximadamente 5 días para la hidrólisis espontánea a pH 7,4 en tampón de fosfato de ácido cítrico (Margison et al., 1973). Además, una cepa mutante resistente aparentemente extirpó la N-7-metilguanina más rápidamente que la cepa sensible con la aparición de mononucleótidos a partir del ADN degradado en el sobrenadante celular (Olson y McCalla, 1969). Esta conclusión inesperada, por lo tanto, merece una investigación más a fondo. Estos hallazgos, junto con la ligera indicación de una pérdida más rápida de 7-metilguanina del ADN de hígado de rata in vivo, observados por Margison et al. (1973), pero no por Craddock (1973a), podría sugerir que este sustituyente de ADN puede ser reconocido por una enzima de reparación bajo ciertas circunstancias.
En el cuadro VI se resumen los ejemplos anteriores de pérdida de productos químicos a partir del ADN bacteriano.