2.4.3.1 Papel de los biocidas en la adquisición y propagación de RAM
Los biocidas, que pueden definirse como sustancias activas y preparados que contienen uno o más compuestos activos destinados a inactivar o ejercer un efecto de control sobre microorganismos nocivos, se utilizan ampliamente para mantener los niveles de higiene requeridos en granjas, mataderos y locales de procesamiento de alimentos . En las granjas, se utilizan para la limpieza y desinfección de áreas asociadas con animales de ganado, incluidos edificios de granjas, ropa de cama, equipos, baños para botas y vehículos de transporte, entre otros. Además, se utiliza habitualmente una serie de biocidas en mataderos y zonas de producción y procesamiento de alimentos para la desinfección de equipos y superficies con el fin de controlar la colonización por microorganismos potencialmente peligrosos. Some of the most widely used biocides are alcohols, aldehydes, chlorine, and chlorine- releasing agents (sodium hypochlorite, chlorhexidine), iodine, peroxygen compounds (hydrogen peroxide, peracetic acid), phenolic type compounds, quaternary ammonium compounds (benzalkonium chloride), bases (sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate), and acids (mineral and organic acids).
Los biocidas se emplean generalmente en granjas, mataderos e industrias alimentarias en concentraciones muy superiores a las concentraciones inhibitorias mínimas (CMI) de todos los principales microorganismos diana y, por lo tanto, deben poder garantizar la inactivación microbiana y evitar el desarrollo de resistencia a los biocidas. Sin embargo, se producen concentraciones de biocidas subóptimas en nichos seleccionados (por ejemplo, debajo de objetos o en grietas y otros sitios de pastoreo) o como consecuencia de un uso indebido. La presencia de materia orgánica (que se sabe inactiva algunos biocidas, como los compuestos clorados) puede reducir su eficacia, mientras que la formulación errónea, el almacenamiento inadecuado de formulaciones y la distribución inadecuada del compuesto en superficies y equipos pueden dar lugar a una disminución de la concentración de biocidas activos en algunos lugares de los locales . También pueden aparecer nichos con bajas concentraciones de biocidas mediante el enjuague de zonas frecuentemente limpiadas y desinfectadas o mediante la aplicación de biocidas en superficies húmedas, con la consiguiente dilución del compuesto a concentraciones que pueden ser subletales para microorganismos. Además, las líneas de eliminación de aguas residuales pueden proporcionar contacto permanente de microorganismos con bajas concentraciones de biocidas. Por ejemplo, se han identificado concentraciones subletales de compuestos representativos de amonio cuaternario, como los compuestos de dialquildimetilamonio y los cloruros de benzalconio, en sedimentos fluviales (26 y 1).5 ppm, respectivamente) y aguas residuales de hospitales (1,5–4 ppm). Lo mismo puede ocurrir con las aguas residuales de granjas, mataderos e instalaciones de procesamiento de alimentos. Por lo tanto, las comunidades microbianas que colonizan ambientes dentro de granjas, mataderos e instalaciones de producción de alimentos (incluidos los ambientes en contacto con alimentos) están expuestas de manera recurrente a concentraciones de biocidas subinhibitorios, y esto puede tener un impacto en la ecología microbiana y la seguridad alimentaria.
Se describió la selección de microorganismos resistentes a biocidas por exposición a concentraciones de biocidas subóptimas para algunos compuestos biocidas y especies microbianas (por ejemplo, Li. monocytogenes-compuestos de amonio cuaternario, hipoclorito de sodio; Salmonella Typhimurium—triclosán; E. coli—fosfato trisódico, nitrito de sodio, hipocloruro de sodio) . La resistencia a los biocidas representa un problema de salud pública potencialmente importante, ya que puede contribuir al aumento de la persistencia de microorganismos patógenos y nocivos en la cadena alimentaria. La persistencia bacteriana, que puede definirse como la supervivencia durante largos períodos de tiempo en un lugar determinado, es una gran preocupación para las industrias alimentarias, ya que puede conducir a la contaminación repetida de los alimentos con microorganismos nocivos o patógenos, lo que afecta gravemente a la salud de los consumidores y causa grandes pérdidas económicas a las empresas alimentarias. Un buen ejemplo de asociación entre persistencia y resistencia a biocidas es el caso de la cepa Li. monocytogenes 6179. Listeria monocytogenes 6179 es una cepa del serotipo 1/2a, aislada en el Centro de Investigación Alimentaria Teagasc (Irlanda) de entornos particulares en una instalación de procesamiento de queso repetidamente durante un período de 12 años . La secuenciación del genoma de Li. monocytogenes 6179 permitió la identificación de un nuevo transposón, Tn6188, que comprendía tres genes de transposasa consecutivos (tnpABC), un gen qacH que codificaba un pequeño transportador de la familia de proteínas de resistencia a múltiples fármacos (SMR) responsable de la exportación de compuestos de amonio cuaternario, y un regulador transcripcional de la supuesta familia tetR aguas arriba del transportador . Las investigaciones también mostraron que la exposición al cloruro de benzalconio (BAC) causaba un aumento en la expresión de qacH y que una cepa mutante de deleción de qacH tenía menor tolerancia a BAC que la cepa de tipo salvaje. Estudios recientes realizados también en Irlanda han identificado varias cepas persistentes indistinguibles de Li. monocytogenes 6179 mediante análisis de electroforesis en gel de campo pulsado que se aislaron de forma recurrente de entornos y alimentos de cinco industrias de mariscos diferentes durante 2013 y 2014. Todas estas cepas albergaban el transposón Tn6188 y tenían una CMI significativamente más alta contra BAC que otras cepas aisladas durante el mismo período de tiempo y que carecían del transposón Tn6188 . Aislados bacterianos como estos, que llevan determinantes de la resistencia a biocidas, persisten en los entornos industriales durante largos períodos de tiempo y son una fuente probable de eventos de contaminación de alimentos.
También ha surgido recientemente la sospecha de que la exposición a concentraciones subóptimas de biocidas puede aumentar la resistencia frente a antibióticos clínicamente relevantes. Algunos estudios realizados en la última década comparando la resistencia a biocidas y antibióticos de colecciones de cepas de los principales patógenos transmitidos por los alimentos revelaron una correlación entre la resistencia a ambos agentes . Lamentablemente, los pequeños conjuntos de datos utilizados y la falta de análisis estadísticos apropiados limitaron los resultados de estos estudios. Más recientemente, Coelho et al. se llevó a cabo un elegante estudio utilizando metodologías de aprendizaje automático para analizar la susceptibilidad a antibióticos y biocidas de la mayor colección de aislados hasta ahora probados para este propósito (1632 aislados), en este caso de St.aureus. They described that reduced susceptibility to two biocides, clorhexidine and BAC, which belong to different structural families, was associated with resistance to several antibiotics (amoxicillin/clavulanate, cefuroxime, cefaclor, cefpodoxime, clindamycin, erythromycin, clarithromycin, azithromycin, telithromycin, ciprofloxacin, levofloxacin, gatifloxacin, and moxifloxacin). Other authors isolated stable mutant strains with increased resistance to one or several antibiotics after exposure to sublethal biocide concentrations. For instance, Langsrud et al. se informó de que el cultivo en serie de dos cepas de E. coli en presencia de concentraciones subinhibitorias de BAC dio lugar a un aumento de la resistencia a diversos antibióticos (ampicilina, penicilina G, norfloxacina, ácido nalidíxico, kanamicina, gentamicina, cloranfenicol, tetraciclina y eritromicina), con valores de CMI de 1,5 a 20 veces superiores a los observados en cultivos de control. Randall et al. describió que la exposición a un desinfectante a base de aldehídos dio lugar a mutantes de S. Typhimurium con una sensibilidad reducida a ciprofloxacino en varias cepas bacterianas. Karatzas et al. , después de un tratamiento prolongado de S. Typhimurium con tres desinfectantes de granja ampliamente utilizados (una mezcla de compuestos oxidantes; un desinfectante de amonio cuaternario que contiene formaldehído y glutaraldehído; y un biocida compuesto de ácidos orgánicos y surfactantes), se obtuvo una variante individual estable de cada tratamiento que mostró una susceptibilidad reducida a una variedad de antibióticos (ciprofloxacina, cloranfenicol, tetraciclina y ampicilina). Whitehead et al. aislaron a dos mutantes de S. Tifimurio después de una sola exposición a concentraciones en uso de dos biocidas (una mezcla de aldehídos y compuestos de amonio cuaternario, y un compuesto de amina terciaria halogenada) que tenían una sensibilidad reducida al ácido nalidíxico, cloranfenicol, tetraciclina y ciprofloxacino. Webber et al. mostró que cuatro biocidas diferentes (una mezcla de aldehídos y compuestos de amonio cuaternario, un compuesto de amonio cuaternario, un compuesto oxidativo y un compuesto de amina terciaria halogenada) seleccionaron mutantes multirresistentes a S. Typhimurium con una susceptibilidad reducida a los antibióticos.
No se sabe completamente cómo la exposición a los compuestos biocidas selecciona una mayor resistencia contra los antibióticos, pero se postulan dos mecanismos, la resistencia cruzada y la coresistencia. Dado que ciertos biocidas y antibióticos comparten las mismas dianas celulares, es probable que algunos determinantes de la resistencia a los biocidas y mutaciones ventajosas que conducen a un aumento de la resistencia a los biocidas también sean responsables de la adquisición de resistencia a los antibióticos en las poblaciones microbianas. Por ejemplo, algunas bombas de flujo de múltiples fármacos, que tienen más de un sustrato que puede no estar químicamente relacionado entre sí, pueden conferir resistencia simultánea a los antibióticos y biocidas cuando están sobreexpresados . Esto se conoce como resistencia cruzada. Además, incluso para aquellos biocidas que no comparten un objetivo con los antibióticos, la susceptibilidad reducida a los antibióticos puede deberse a la transferencia horizontal de varios determinantes de resistencia diferentes (determinantes de la resistencia a los antibióticos y determinantes de la resistencia a los biocidas) asociados juntos en elementos genéticos comunes como plásmidos, fagos, integrones o transposones, que pueden propagarse a otras cepas, especies o géneros . Esto se conoce como resistencia. Un ejemplo de este fenómeno son los integrones de clase 1, que se sabe que contienen una amplia gama de casetes de genes, incluida cierta resistencia codificante a diferentes antibióticos y compuestos de amonio cuaternario. De hecho, la existencia de reservorios ambientales de integrones de clase 1 se conoce desde hace algún tiempo y el gen intI1 de la integrasa de clase 1 se ha propuesto recientemente como biomarcador de presiones selectivas impuestas por la contaminación antropogénica . Los microorganismos (incluidos los no patógenos y los no cultivables) presentes en los alimentos y en los entornos relacionados con los alimentos pueden desempeñar un papel importante en los eventos de resistencia. De hecho, son buenos reservorios de genes de resistencia a los antimicrobianos (RAM) y pueden facilitar la diseminación del gen de la RAM en diversos ecosistemas ambientales, incluidos los ecosistemas alimentarios .