Electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional (PÁGINA 2D): avances y perspectivas

Introducción

Los últimos 25 años, y en particular la última década, han sido testigos de un mayor esfuerzo por desarrollar tecnologías capaces de identificar y cuantificar un gran número de proteínas expresadas dentro de un sistema celular (es decir, el proteoma) con la esperanza de detectar biomarcadores de enfermedades, mapear circuitos de proteínas o identificar nuevos sitios de fosforilación, por ejemplo. La complejidad del proteoma ha hecho que el desarrollo de métodos para la separación eficiente y la detección sensible de proteínas sea un componente crítico de este esfuerzo. Los continuos avances en la tecnología de espectrometría de masas (MS) han permitido la detección de proteínas con una velocidad y sensibilidad mucho mayores de lo que antes era posible. Sin embargo, incluso la esclerosis múltiple de vanguardia es incapaz de caracterizar todos los componentes dentro de un proteoma complejo. Los científicos adoptan un enfoque de «divide y vencerás» para caracterizar los proteomas, en el que intentan limitar temporalmente el número de proteínas que el espectrómetro de masas debe analizar. Al extender el proteoma, se analizarán más proteínas en un experimento individual.

Para separar los proteomas, los científicos han utilizado tecnologías electroforéticas y cromatográficas, por separado y en combinación, tanto fuera de línea como en línea. Aunque estos esfuerzos pueden resultar en la separación e identificación de miles de proteínas, ningún método puede resolver todas las proteínas en un proteoma, debido a su gran número y rango dinámico de concentración. Las separaciones de una sola dimensión son inadecuadas para resolver eficazmente mezclas de proteínas complejas. Este hecho fue reconocido hace más de medio siglo por Smithies y Poulik (1), quienes reconocieron que una combinación de dos procesos electroforéticos en un gel en ángulo recto debería dar un grado de resolución mucho mayor de lo que es posible con cualquiera de los dos por separado. Los dos procesos electroforéticos son la resolución por tamaño molecular y la movilidad de la solución libre en un gel de almidón. Su predicción sigue siendo cierta y ha constituido la base para el desarrollo de metodologías multidimensionales ortogonales para la separación de mezclas complejas no solo por electroforesis en gel, sino también por cromatografía y electroforesis capilar.

Para comprender adecuadamente los avances realizados en la PÁGINA bidimensional (PÁGINA 2D), uno necesita retroceder mucho más de un cuarto de siglo. En 1930 Tiselius introdujo el método de límites móviles como una herramienta analítica para estudiar la electroforesis de proteínas (2). Desde su trabajo pionero, se han utilizado varias formas de electroforesis para la separación de mezclas complejas de proteínas, cada una con una resolución mejorada. Ya en 1962, Raymond y Aurell (3) demostraron los efectos no lineales significativos de la concentración de gel en la movilidad electroforética de las proteínas mediante el empleo de electroforesis 2D utilizando diferentes concentraciones de gel de acrilamida para separar las proteínas séricas. Dos años más tarde, Raymond (4) demostró la superioridad de los geles de losa plana en comparación con los geles de tubo cilíndrico. Por ejemplo, la losa plana proporciona la máxima superficie para enfriar el gel; los patrones resultantes son más fáciles de cuantificar en densitómetros de registro estándar; un gran número de muestras se pueden procesar utilizando una sola placa de gel, lo que facilita la comparación directa de muestras procesadas en condiciones idénticas; y, lo más importante, la losa plana permite la aplicación de separaciones 2D. Estas preferencias perspicaces se han demostrado verdaderas y se practican hoy en día en muchos laboratorios bioanalíticos.

Otro avance en las separaciones de gel en 2D fue introducido en 1972 por Wright (5), que utilizó una columna de gel de poliacrilamida al 4,75% (2% de unión cruzada) en la primera dimensión, que luego se retiró del cilindro de vidrio y se colocó en el borde superior de una losa de gradiente al 2%. Después de la electroforesis, la placa de gel se colocó en una solución de tinción, lo que resultó en la visualización de 112 proteínas séricas humanas resueltas.

Estos nuevos enfoques resolvieron solo un pequeño número de proteínas, principalmente las proteínas más abundantes de una célula o proteoma sérico. La introducción de 2D-PAGE en 1975 por O’Farrell (6) para separar proteínas celulares en condiciones de desnaturalización permitió la resolución de cientos de proteínas. El principio aplicado era muy sencillo: las proteínas se resolvieron en un gel utilizando el enfoque isoeléctrico (FEI), que separa las proteínas en la primera dimensión de acuerdo con su punto isoeléctrico, seguido de electroforesis en una segunda dimensión en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS), que separa las proteínas de acuerdo con su masa molecular. El método de O’Farrell es realmente la base de la moderna PÁGINA 2D, que fue rápidamente adaptada y ampliamente aceptada por otros investigadores. Anderson y Anderson (7) utilizaron 2D-PAGE para el análisis de proteínas plasmáticas humanas. Fueron capaces de separar y detectar aproximadamente 300 manchas de proteína distintas tras la tinción. A diferencia de O’Farrell, Manabe (8) separó las proteínas plasmáticas humanas utilizando 2D PÁGINAS sin agentes desnaturalizantes. Se observaron alrededor de 230 manchas de proteína en el gel; sin embargo, las manchas se untaron y no se resolvieron bien.

Introducción de gradientes de pH inmovilizados

Como se mencionó anteriormente, la PÁGINA 2D comprende el IEF en la primera dimensión, seguida de la PÁGINA SDS en la segunda dimensión. Desde su introducción por Kolin en 1954 (9), el IEF ha experimentado varios avances. La primera dimensión se realiza en varillas de gel de poliacrilamida que se forman en tubos de vidrio o plástico y contienen anfólitos que forman un gradiente de pH en un campo eléctrico. Estas barras eran históricamente irreproducibles, inestables y difíciles de trabajar. La introducción de gradientes de pH inmovilizados (IPGs) por Bjellqvist et al. (10) tuvo un impacto significativo en el uso de FEI para separar mezclas complejas en un amplio rango de pH. El IPGs permitió la formación de gradientes de pH estables y reproducibles capaces de enfocar proteínas ácidas y básicas en un solo gel preparado con gradientes de pH amplios. En IPGs, los anfólitos portadores se unen a moléculas de acrilamida y se funden en los geles para formar un gradiente de pH fijo. La fijación del gradiente evita la deriva en el gel y también garantiza que se puedan fundir de manera eficiente y reproducible. El uso de tiras IPG de rango estrecho permitió separar un mayor número de proteínas de lo que había sido posible con la PÁGINA 2D estándar porque un rango de pH más estrecho se extendió a una distancia física mayor. Esta dispersión permitió que proteínas con valores de punto isoeléctrico (pI) similares se separaran con mayor resolución. Para ilustrar este punto, Hoving et al. se desarrolló un método de PÁGINA 2D en el que se aplicaron tiras IPG de rango estrecho en la primera dimensión (11). Las tiras IPG eran típicamente de 1-3 pH U de ancho y se solapaban entre sí por al menos 0,5 pH U. Se utilizaron seis tiras IPG que cubrían el rango de pH de 3,5 a 10. Se aplicaron proteínas de una línea celular de linfoma B a cada tira y se separaron mediante FEI. Luego, cada tira se aplicó a una placa de gel de página SDS individual y las proteínas se separaron en la segunda dimensión en función de su peso molecular. Se detectaron aproximadamente 5000 puntos distintos utilizando las seis tiras IPG, en comparación con 1500 puntos detectados utilizando una sola tira IPG con un rango de pH de 3-10 y una sola placa de gel estándar de 2D PÁGINAS. Wildgruber et al. (12) comparó el uso de 3 tiras IPG con rangos de pH de 4-5, 5-6 y 5.5–6.7 contra geles corridos con tiras IPG con rangos de gradiente de pH de 3-10 y 4-7. Fueron capaces de detectar 2,3 y 1,6× más puntos de proteína usando tres tiras de IPG de rango estrecho que con las dos tiras de IPG de rango de gradiente más amplio (3-10 y 4-7), respectivamente.

Mientras que la resolución más alta que se puede obtener usando IPGs estrechos superpuestos múltiples permite la identificación de más proteínas, cada tira estrecha requiere una placa de gel separada y una cierta cantidad de la misma muestra para cargarse en cada una. Este requisito significa que, si el volumen o la concentración de la muestra es limitado, tal experimento puede no ser posible. Para muestras limitadas, debe considerarse un rango de pH más amplio o un número mínimo de IPGs.

Electroforesis Diferencial Bidimensional en gel (2D-DIGE)

El objetivo de separar proteínas utilizando 2D-PAGE es doble: i) identificación de nuevas proteínas y ii) medición de su abundancia relativa entre muestras comparativas. Una ventaja de 2D-PAGE como técnica de separación es que no solo resuelve grandes cantidades de proteínas, sino que la tinción de estas proteínas permite cuantificar la abundancia relativa de las proteínas. Por ejemplo, las proteínas extraídas de dos muestras de suero (sanas y enfermas) se cargan en una placa de gel separada. Después de la tinción, las manchas de proteína se alinean y escanean para medir sus intensidades individuales. Si bien se han realizado muchos avances en las herramientas de alineación de software, ha sido difícil garantizar la comparación directa punto a punto entre dos geles separados. El desarrollo de la electroforesis diferencial en gel en 2D (DIGE) en 1997 superó esta limitación al permitir que se separaran hasta tres mezclas de proteínas distintas en un solo gel de 2D PÁGINAS (13). En un experimento típico de 2D-DIGE, las proteínas extraídas de tres muestras diferentes, sanas, enfermas y de control interno (una muestra agrupada formada a partir de la mezcla de cantidades iguales de las proteínas extraídas de las muestras sanas y enfermas), se etiquetan covalentemente, cada una con un tinte fluorescente de cianina que tiene una longitud de onda de excitación y emisión diferente. Las muestras son compatibles con la migración, de modo que la misma proteína etiquetada con cualquiera de los tintes migrará a la misma posición en el gel. Los tintes de cianina que se han utilizado son: 1-(5-carboxi-pentil)-1′-propylindocarbacyanine de haluro de N-hidroxisuccinimidil éster (Cy3); 1-(5-carboxypentyl)-1′-methylindodicar-bacyanine de haluro de N-hidroxisuccinimidil éster (Cy5); y 3-(4-carboximetil)fenilmetílico-3′-ethyloxacarbacyanine de haluro de N-hidroxisuccinimidil Éster (cy2). Se mezclan concentraciones iguales de las proteínas con etiquetas diferentes y de la muestra de control, se aplican a una sola placa de gel y se separan utilizando una PÁGINA 2D. La muestra de control sirve como un estándar interno, lo que permite la coincidencia entre gel e intragel. La muestra de control debe contener todas las proteínas presentes en todas las muestras de un experimento. Esto significa que cada proteína en el experimento tiene una señal única en el estándar interno, que se utiliza para comparaciones cuantitativas directas dentro de cada gel y para normalizar los valores cuantitativos de abundancia para cada proteína entre geles. El escaneo del gel en las longitudes de onda de excitación específicas de cada tinte, utilizando una cámara de fluorescencia, permite la visualización de las proteínas etiquetadas diferencialmente (Figura 1). Las imágenes se fusionan y analizan utilizando un software de imágenes, que permite comparar las diferencias entre los niveles de abundancia de proteínas. El valor de DIGE elimina cualquier error relacionado con la desalineación del gel y garantiza una cuantificación precisa (14).

Las proteínas de interés se extraen del gel, se digieren proteolíticamente y se identifican mediante la EM. Dado que se realiza con una sola placa de gel, 2D-DIGE requiere un 50% menos de geles, lo que lo hace más económico y las diferencias en la expresión de proteínas entre dos muestras diferentes de proteínas son más fáciles de comparar y obtener imágenes con mayor precisión. Además, se requiere menos tiempo para detectar las manchas de proteína porque la reacción de etiquetado en DIGE es más rápida que la visualización mediante métodos de tinción. Cuando es necesario comparar los niveles de expresión de proteínas de dos muestras diferentes, DIGE es el método de elección (15).

Fortalezas y debilidades de la PÁGINA 2D

La electroforesis es una técnica establecida que ha sufrido varios avances que han mejorado la resolución, detección, cuantificación y reproducibilidad. Los enfoques 2D SDS-PAGE y 2D-DIGE para el perfilado de proteínas son métodos accesibles y económicos que poseen un alto poder de resolución y permiten la detección de cientos de proteínas en una sola placa de gel. Aunque la reproducibilidad ha sido un problema con 2D-PAGE, especialmente al perfilar dos mezclas de proteínas, se ha mejorado mucho con el uso de 2D-DIGE. La resolución se ha mejorado con la introducción de IPGs, que permiten al analista adaptar el gradiente de pH para obtener la máxima resolución utilizando geles ultrazoom con un rango de gradiente de pH estrecho. Con la PÁGINA 2D moderna, no es inusual resolver dos proteínas que difieren en pI en 0.001 U.

Aunque la PÁGINA 2D se ha limitado por su incapacidad para resolver proteínas que son demasiado básicas o demasiado ácidas, demasiado grandes o demasiado pequeñas, esta limitación está disminuyendo continuamente. Por ejemplo, la separación de proteínas básicas se puede analizar utilizando IPGs en el rango de pH de 4-12. La ciencia de la separación siempre está evolucionando, y no pasará mucho tiempo antes de que los problemas restantes de la electroforesis en gel se resuelvan adecuadamente.

La introducción de 2D-DIGE contribuyó enormemente a resolver los problemas de reproducibilidad y cuantificación. El uso de generadores de imágenes y computadoras permite no solo la extracción, adquisición y análisis rápidos de datos, sino también la detección de puntos, la normalización, el perfil de proteínas, la corrección de fondo y la generación de informes y exportación de datos. Como técnica de separación, detección y cuantificación, 2D-DIGE es una herramienta importante, especialmente para los laboratorios clínicos que participan en la determinación de los niveles de expresión de proteínas y el descubrimiento de biomarcadores de enfermedades. Cuando el objetivo principal es la variación biológica absoluta entre muestras, como en el descubrimiento de biomarcadores, el método de elección es la DIGE 2D.

Si bien ha habido un progreso significativo en los métodos nongel (o basados en soluciones) para acoplar los métodos de fraccionamiento directamente en línea con el análisis de MS, la página 2D ha seguido siendo una técnica popular para realizar estudios proteómicos. Aunque la PÁGINA 2D, como cualquier esquema de fraccionamiento, tiene sus ventajas y desventajas, no hay duda de que seguirá siendo una técnica esencial para la caracterización de proteomas durante muchos años.