Factores que se unen al promotor proximal pro-COL1A2
Se han identificado varios elementos funcionales de acción cis en el promotor proximal de aproximadamente 400 pb del gen pro-Col1a2 de ratón (154-2350 pb) y en la secuencia mínima humana entre 152 y 2378 pb. El primer factor de transcripción encontrado para unirse a este promotor fue la proteína ubicua de unión a CCAAT CBF. Este factor de transcripción está formado por tres subunidades separadas, llamadas A, B y C, que han sido clonadas y secuenciadas (Maity y de Crombrugghe, 1998). Las tres subunidades son necesarias para que el CBF se una a la secuencia que contiene la caja CCAAT ubicada entre 284 y 280 y active la transcripción en genes humanos y de ratón (ver Fig. 13.2 B). Los datos in vitro sugieren que las subunidades A y C se asocian primero para formar un complejo A-C y que este complejo luego forma una molécula heteromérica con la subunidad B(Sinha et al., 1995). Las mutaciones en la caja CCAAT que impiden la unión del CBF disminuyen la actividad transcripcional del promotor proximal pro-Col1a2 de tres a cinco veces en experimentos de transfección transitoria de líneas celulares fibroblásticas (Cousty et al., 1995). El CBF purificado, así como el CBF compuesto de sus tres subunidades recombinantes, también activan el promotor pro-Col1a2 en extractos nucleares libres de células previamente agotados de CBF (Cousty et al., 1995). Dos de las tres subunidades de CBF contienen dominios de activación transcripcional. Más recientemente, una sola sustitución de T a A in vivo en presencia de un potenciador aguas arriba de la secuencia humana sugirió que el CBF está involucrado en el patrón de la expresión de colágeno tipo I en el eje dorsoventral y rostrocaudal de los fibroblastos de piel de ratón (Tanaka et al., 2004).
Además del sitio de unión para el CBF, los experimentos de huellas dactilares y los estudios de cambio de gel identificaron otros sitios de unión en los primeros 350 pb del promotor pro-Col1a2 de ratón. Se ha demostrado que tres secuencias ricas en CG, ubicadas a aproximadamente 2160 pb (entre 2176 y 2152 pb) y 2120 pb (entre 2131 y 2114 pb) interactúan con proteínas de unión al ADN mediante experimentos de huella y ensayos de cambio de gel (Hasegawa et al., 1996). Una deleción en el promotor de ratón que abarcaba estas tres secuencias con huellas abolió por completo la actividad transcripcional del promotor proximal pro-Col1a2 en experimentos de transfección transitoria utilizando líneas celulares fibroblásticas. Las regiones correspondientes en el promotor humano pro-COL1A2 también se protegieron en experimentos de huellas dactilares in vivo e in vitro(Nhi et al., 1996) y activadores transcripcionales encuadernados. Sin embargo, los ensayos de desplazamiento de gel realizados utilizando el promotor pro-COL1A2 humano han sugerido que un elemento de acción cis ubicado a 2160 pb representa un elemento represor (Nhi et al., 1996), lo que implica que las interacciones entre las proteínas que interactúan con los elementos activadores a 2300, 2125 y 280 pb y las proteínas que se unen a un elemento represor a 2160 pb regulan este gen. Más recientemente, se demostró que CUX1, una proteína de desplazamiento CCAAT, se asocia con una expresión reducida de colágeno tipo I tanto in vivo como in vitro y que mejorar la expresión de CUX1 resulta en una supresión efectiva del colágeno tipo I al interferir con la unión al CBF (Fragiadaki et al., 2011).
Se ha demostrado que Sp1 y Sp3 se unen al motivo TCCTCC ubicado entre 2123 y 2128 pb; ambos factores de transcripción activan este promotor (Ihn et al., 2001) (véase la Fig. 13.2 B). Además, las proteínas que se unen a los dos segmentos proximales también se unen al segmento más rico en GC aguas arriba, a 2300 pb, con la excepción del CBF, lo que sugiere una redundancia entre los segmentos de ADN funcionalmente activos del promotor proximal pro-COL1A2.
TGFß media su acción en el promotor humano a través de la combinación del factor de transcripción ubicuo Sp1, el complejo Smad3/4 y los coactivadores p300/proteína de unión a CREB (CBP) en lo que se denomina un elemento de respuesta a TGFß (TßRE) (Zhang et al., 2000). Este segmento contiene tres motivos ricos en GC entre 2330 y 2255, capaces de unirse a Sp1, proteína de unión a CCAAT/potenciador (C/EBP), proteína activadora 1 (AP1) y complejos Smad (Chen et al.,1999, 2000a, b; Kanamaru et al., 2003; Tamaki et al., 1995; Zhang et al., 2000). La interacción entre estos factores nucleares es sinérgica y requiere la unión de Sp1 y Smad3/4 a los elementos ricos en CG y al sitio de CAGAC Smad aguas abajo, respectivamente (Ghosh et al., 2000; Poncelet y Schnaper, 2001; Zhang et al., 2000). A comienzos de este siglo, hubo un gran debate sobre si Smads son más importantes que AP1 en el promotor proximal. Esto se resolvió unos 10 años más tarde, cuando se demostró que el TGFß también activa el gen COL1A2 a través de una vía de señalización no canónica (independiente de Smad), que requiere la cooperación potenciador/promotor que implica el intercambio de la ocupación del factor de transcripción c-Jun/JunB de un sitio crítico potenciador, lo que resulta en la estabilización de la coalescencia potenciador/promotor (Ponticos et al., 2009). Un informe que explora los efectos de la hipoxia y el TGFß en el gen COL1A2 ha añadido al papel potencial de los Smad, en particular Smad3, en la regulación de la expresión de colágeno. Estos estudios en células mesangiales humanas sugieren que en condiciones hipóxicas y en presencia de TGFß, el factor 1α inducible a hipoxia (HIF-1α) y Smad3 pueden formar complejos transcripcionales y mejorar preferentemente la unión a uno de los tres elementos de respuesta a hipoxia dentro del promotor COL1A2 humano en la posición -335 bp (Baumann et al., 2016). Los autores sugieren que esta interacción novedosa proporciona un mecanismo que explica la sinergia observada entre HIF y TGFß en la fibrosis renal.
el TNFa y el interferón-γ (IFN-γ) suprimen la producción de la matriz. En contraste con el elemento único de ADN que media la estimulación de TGFß del promotor proximal COL1A2, se ha demostrado que tanto el TNFa como el IFN-γ inhiben la transcripción de COL1A2 al interferir con la formación del complejo inducido por TGFß y estimular la interacción de factores negativos con elementos de ADN sensibles ubicados en 5′ y 3′ de él. Este llamado «elemento sensible a citoquinas» juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis. La implicación de AP1 y NF-kB en la transducción de la acción inhibitoria del TNFa en la expresión génica de COL1A2 se ha demostrado utilizando fibroblastos inmortalizados de ratones que carecen del activador de AP1, la cinasa N-terminal Jun 1 (JNK1) o del modulador esencial NEMO de NF-kB. Específicamente, la pérdida de JNK1 previno el antagonismo del TNFa del TGFß, pero preservó la inhibición del TNFa de la expresión constitutiva de COL1A2. El antagonismo de TGFß por TNFa implica la fosforilación de JNK1 de c-jun, lo que lleva a la competencia fuera del ADN de esta última molécula para unirse a Smad3 al sitio del ADN afín y/o para interactuar con los coactivadores p300/CBP (Kouba et al., 1999; Verrecchia et al., 2001, 2002).
La unión de IFN-γ a sus receptores conduce a la fosforilación de tirosina de la cinasa janus (JAK), y esto a su vez da lugar a la fosforilación de transductor de señal y activador de transcripción (STAT1). En COL1A2, la activación de STAT1 compite con Smad3 por la interacción con p300 / CBP (Inagaki et al., 2003). Además, JAK1 también puede activar el factor de transcripción factor de unión a la caja Y (YB-1); esta activación resulta tanto en la inhibición de la actividad promotora constitutiva a través de la unión YB-1 de la caja 2125TC como en el antagonismo de las señales TGFß a través de la competencia YB-1 con Smad3 y/o p300/CBP (Ghosh et al., 2001; Higashi et al., 2003). Para más detalles, consulte «Factores de crecimiento» y » Citoquinas.»
Est1 / Fli1 también se ha demostrado que se une a la misma secuencia con efectos opuestos en la transcripción de colágeno tipo I. Se identificó un factor de transcripción Ets funcional en COL1A2 en las proximidades de los sitios Sp1. El Ets1 estimuló, mientras que el Fli1 inhibió, la actividad promotora. La unión de Sp1 fue esencial para la inhibición de Fli1. Además, la sobreexpresión de Fli1 en fibroblastos dérmicos condujo a una disminución en los niveles de ARNm y proteínas de COL1A2 (Czuwara-Ladykowska et al., 2001). Además, el tratamiento con TGFß de los fibroblastos dérmicos conduce a la disociación de la Ets1 de los complejos CBP/p300 y altera su respuesta a la TGFß en favor de la degradación de la matriz (Czuwara-Ladykowska et al., 2002).
Además, se ha demostrado que un motivo CpG a 17 pb está metilado preferentemente y unido por proteínas RFX en células que adquieren un estado I negativo de colágeno. Los experimentos de transfección celular junto con los ensayos de unión al ADN han asignado propiedades positivas o negativas a cada una de las proteínas que se unen al promotor proximal de pro-COL1A2 (Sengupta et al., 2002). Por otro lado, se ha demostrado que el grado de metilación en el sitio de 17 CpG modula la afinidad de unión de las proteínas RFX y, en consecuencia, su capacidad de regular a la baja la actividad promotora al reclutar proteínas asociadas que interfieren con el ensamblaje de complejos transcripcionales de acción positiva (Xu et al., 2003, 2004).