Un modelo basado en reglas de la vía de señalización de insulina

El modelo de la vía de señalización de insulina

A partir de tres modelos publicados , implementamos el modelo de ISP como se muestra en la Fig. 1 usando la Notación Gráfica de Biología de Sistemas .

El modelo comprende muchos de los elementos esenciales responsables de la acción de la insulina, ya que se incluyen las tres sub-vías principales del ISP, descritas brevemente a continuación.

La vía PI3K-AKT

Para la vía PI3K-Akt, nos referimos principalmente al modelo de Sedaghat et al. . El modelo ha sido utilizado por varios grupos de investigación e incluye muchos de los componentes de señalización más conocidos que median la translocación del transportador de glucosa GLUT4. Estos incluyen los subsistemas de unión al receptor de insulina y reciclaje; el subsistema de señalización post-receptor que incluye tanto la fosforilación Ser como la Tir en el sustrato del receptor de insulina 1 (IRS1); la formación de un complejo (complejo IRS1_PI3K) entre IRS1 fosforilados y fosfatidilinositida 3-quinasa (PI3K) ; los fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfatos PI (3,4,5) P3, síntesis; la fosforilación de la proteína quinasa B (AKT) y la proteína quinasa C (PKC)-ζ; la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática. Los efectos de la proteína tirosina fosfatasa (PTP1B) y las fosfatasas lipídicas (SHIP2 y PTEN) también se consideran en el modelo.

La vía TSC1/2-mTOR

Para la vía TSC1/2-mTOR nos referimos principalmente al modelo publicado recientemente en Sonntag et al. , que describe el efecto mTOR en respuesta a la insulina y los aminoácidos. El modelo considera ambos complejos mTOR: mTORC1 y mTORC2. La activación de mTORC1 depende de la presencia de aminoácidos y es inhibida por la activación de las proteínas de esclerosis tuberosa 1 y 2 (TSC1/2) (es decir, fosforilación Ser), que, a su vez, depende de la activación de la proteína quinasa activada por 5′ AMP (AMPK). La activación de AMPK depende de la fosforilación de IRS1 Tyr, mientras que la inhibición de TSC1/2 (es decir, fosforilación de Tyr) depende de la fosforilación de AKT en Thr309. mTORC2, que se identificó recientemente como la proteína quinasa 2 dependiente de fosfoinositidasa desconocida (PDK2), es decir. la quinasa responsable de la fosforilación de Ser474 de AKT, contribuye a la doble fosforilación de AKT junto con la fosforilación Thr309, operada por la proteína quinasa dependiente de fosfoinositidos 1 (PDK1). Sonntag et al. formular la hipótesis de la presencia de una variante PI3K, que está regulada directamente por el receptor de insulina activado y, a su vez, activa mTORC2. Incluimos esta hipótesis en nuestro modelo.

La vía RAS-MAPK

Para la vía RAS-MAPK, nos referimos principalmente al modelo de Borisov et al. , describiendo tanto el EGF como las estimulaciones de insulina. El modelo incluye todos los principales mecanismos químicos involucrados en la vía RAS-MAPK: la interacción de IRS1 fosforilado Tyr con SHP2 (la proteína quinasa tirosina 2 que contiene el dominio SH2) y el complejo GRB2-SOS (el receptor del factor de crecimiento unido a 2 y el complejo hijo de siete sin siete), formando así los complejos SHP2-IRS1 y GRB2/SOS-IRS1, respectivamente; la unión al GTP del RAS; la fosforilación de la serina/treonina protooncogénica RAF proteína quinasa (c-RAF); la interacción del receptor de insulina con la proteína activadora de GTPasa Ras (RASGAP), que a su vez cataliza el proceso inverso de desactivación de Ras; la activación de la proteína tirosina quinasa protooncogénica SRC, que activa completamente la c-RAF; la quinasa activada por mitógeno de doble especificidad 1/2 (MEK1/2); las quinasas reguladas por señal extracelular (ERK1/2).

Integración de las vías PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR y RAS-MAPK

Las vías PI3K-AKT, TSC1/2-mTOR y RAS-MAPK contienen varias partes superpuestas, que, en los documentos originales, a menudo se modelaron de diferentes maneras basándose en suposiciones ligeramente diferentes. Comparamos las reacciones superpuestas entre diferentes modelos e implementamos la versión más actualizada de ellos basada en el conocimiento actual de la bioquímica celular. Además, la integración de los tres modelos requería abordar las diferentes unidades de medida adoptadas para describir las variables de estado. Mientras que los experimentos con inmunoblots permiten obtener información importante sobre la escala de tiempo de los eventos de señalización, la información cuantitativa sobre la expresión de proteínas a menudo es problemática para recuperar, de modo que los perfiles de concentración predichos a veces se reportan en la concentración micromolar, como en Borisov et al. o en unidades arbitrarias (UA), como en Sonntag et al. . En contraste, en Sedaghat et al. , la concentración se expresó en unidades molares o en porcentaje de la concentración total (por ejemplo, se consideró que la concentración de citosol de GLUT4 era del 96% de la concentración total de GLUT4 en la célula en el estado basal).

Potencialmente, el RBM permite realizar simulaciones deterministas y estocásticas, siempre que las cantidades de las variables se expresen en copias de moléculas por célula. Aunque en el presente trabajo, realizamos la simulación estocástica, que se suman todas las variables a una misma unidad, es decir, número de moléculas por célula, multiplicando las unidades molares por NA * V (NA indica el número de Avogadro y V el volumen celular, considerado igual a 3e-12 l). Todos los detalles sobre la conversión de unidades a partir de UA y las concentraciones porcentuales se dan en Material y Métodos.

El modelo resultante consta de 42 reglas de reacción y 101 parámetros que codifican las interacciones entre 61 especies químicas distintas. Las reacciones, los valores de los parámetros y las condiciones iniciales se informan en el archivo adicional 1.

Novedades del modelo RBM-ISP

La implementación de RBM, facilitó la contabilidad de varias de las características del ISP, como la fosforilación de proteínas de señalización en múltiples sitios y con múltiples efectos, la interacción simultánea de moléculas con diferentes socios de unión y la localización subcelular de algunas reacciones. Las características enumeradas anteriormente se discuten en detalle a continuación.

Fosforilación de proteínas de señalización en múltiples sitios

Las moléculas de señalización pueden tener diferentes niveles de actividad, dependiendo de los residuos fosforilados. Consideremos, por ejemplo, IRS1 y AKT. IRS1 tiene muchos residuos potencialmente involucrados en modificaciones post-traduccionales y puede ser activado o inhibido en su acción quinasa, dependiendo de que el residuo fosforilado sea Tyr o Ser . Por ejemplo, la fosforilación Tyr-896 es necesaria para la unión a PI3K, SHP2 y GRB2, mientras que la fosforilación Ser-636 por p70S6K es un mecanismo relacionado con la resistencia a la insulina . AKT, por el contrario, puede ser activado por fosforilación en Thr309 o Ser474 por PDK1 y mTORC2, respectivamente .

La activación / inhibición dependiente de la fosforilación IRS1 ya estaba incluida en el modelo Sedeghat, aunque considerando la fosforilación Ser regulada por PKC y no por p70S6K, como en el modelo Sonntag. Aquí modelamos las acciones PKC y p70S6K y describimos la formación/disociación compleja pIRS1-Tyr896 con PI3K , SHP2 y GRB2 .

Los dos sitios de fosforilación de AKT no fueron modelados explícitamente en Sedaghat et al. . Modelamos la fosforilación de AKT en Thr mediada por PI(3,4,5)P3 como en Sedaghat et al. el modelo y la fosforilación de AKT en la Ser mediada por mTORC2 como en Sonntag et al. modelo y supuesto:

i)
AKT fosforilado en Thr o en ambos sitios para actuar sobre el complejo TSC1/2 mediando su fosforilación en Tyr y desfosforilación en Ser ;
ii)
Fosforilación de AKT en la Ser o en ambos sitios para inactivar la C-RAF ;
iii)
Fosforilación de AKT en Thr o Ser para activar la translocación de GLUT4 .

Interacción con múltiples socios de unión

La interacción de las moléculas en las vías de señalización con numerosos socios de unión diferentes resulta en la formación potencial de diferentes complejos. En ISP, IRS1 fosforilado en Tyr-896 puede unirse a PI3K según el modelo de Sedaghat et al. o GRB2 / SOS y SHP2, según el modelo de Borisov et al. . Para hacer coincidir la especificación del modelo RBM-ISP con el conocimiento actual, permitimos la formación de diferentes complejos. Por lo tanto, IRS1 puede unir de manera mutuamente excluyente GRB2/SOS y SHP2, pero puede unir simultáneamente GRB2/SOS y la subunidad reguladora p85 de PI3K .

Información sobre la localización subcelular en las reglas de reacción

La posibilidad de que las proteínas interactúen a menudo está relacionada con su localización física, es decir, su presencia en el espacio extracelular, citoplasma, núcleo, membrana plasmática, etc. Por ejemplo, los lípidos PI(3,4,5)P3 funcionan como sitios de acoplamiento de membrana plasmática que reclutan diferentes proteínas que contienen dominios de homología de pleckstrina (PH) (p. ej. AKT y PDK1) y su co-localización puede acelerar eventos de señalización específicos . Otro ejemplo es la interacción de mTORC1 con el homólogo Ras enriquecido en el cerebro (RHEB) y la familia Rag en la membrana lisosómica, reportada por Zoncu et al. . En nuestro modelo, incluimos la información sobre la localización subcelular del receptor de insulina y el transportador de GLUT4, distinguiendo entre su localización plasmática y citoplasmática de acuerdo con la descripción matemática dada por Sedaghat et al. .

Predicciones del modelo

Los perfiles de concentración de todas las especies químicas que poblaban el modelo se simularon a 60 min, estimulación de insulina de 100 nM. La concentración de 100 nM representa un nivel bien aceptado de estimulación de insulina en cultivos celulares comúnmente encontrados en la literatura y utilizados también por nuestro grupo . Según Sonntag et al. , también asumimos una estimulación constante de aminoácidos, necesaria para obtener la activación de mTORC1 y la retroalimentación de p70S6K en IRS1. Para evaluar la fiabilidad del modelo, se compararon las predicciones del modelo con los datos experimentales disponibles en nuestro conjunto de datos para algunas fosfoproteínas en el tiempo 2, 5, 10, 30 y 60 min después de la estimulación de insulina más aminoácidos, es decir, leucina . Como se muestra en la Fig. 2, los perfiles experimental y predicho de pAKT-S473 y pmTORC1-S2448 están en buen acuerdo, ya que ambos muestran un patrón de fosforilación creciente que alcanza un estado estacionario en los primeros 2-5 min y 20-30 min, respectivamente. El perfil predicho para ppERK1/2-Y202,Y204 es confirmado por los datos experimentales en los primeros 10 minutos, mientras que en los últimos puntos de tiempo disminuye rápidamente en los datos experimentales con respecto a las predicciones del modelo. El perfil observado en los datos experimentales para ppERK1/2-Y202,Y204, podría ser más similar aumentando la fuerza de la retroalimentación entre ppERK1/2-Y202,Y204 y GRB2/SOS. En la Fig. 2 (panel superior derecho, línea de puntos), se muestra el perfil simulado de ppERK1/2-Y202, Y204 obtenido multiplicando el parámetro kcat39 (ver archivo Adicional 1) por un factor de 10. Tenga en cuenta que en el modelo de ISP de RBM disponible en línea, decidimos dejar el parámetro del modelo sin cambios, es decir , usamos el valor de la literatura, posponiendo la optimización de parámetros para estudios futuros, cuando haya más datos disponibles. Desafortunadamente, los datos experimentales de pP70S6K-T389 no fueron confiables (solo una réplica disponible), por lo que no podemos comparar los perfiles experimentales y simulados de esta proteína, que es un punto final de la vía con una importante acción de retroalimentación sobre IRS1. Sin embargo, el perfil simulado que se muestra en la Fig. 2 (panel inferior derecho) se asemeja a los datos experimentales mostrados en otros artículos .

Examinamos los perfiles predichos de todas las especies activas y los agrupamos en cuatro grupos de acuerdo con su comportamiento dinámico, como se muestra en la Fig. 3:

Respuesta rápida, alcanzando el estado estacionario en 2-5 minutos (azul)
Respuesta de rebasamiento rápido, alcanzando el pico en 2-5 minutos y luego el estado estacionario después de 10-20 minutos (verde)
Respuesta lenta, alcanzando el estado estacionario en 10-20 minutos (naranja)
Respuestas de rebasamiento lento, alcanzando el pico en 5-10 minutos y el estado estacionario en 30-60 minutos (púrpura).

Después de la estimulación con insulina, el receptor de insulina responde rápidamente fosforilando y desencadenando una cascada de eventos a lo largo de distintas vías. A lo largo de la vía PI3K-AKT, todos los mecanismos estrechamente relacionados con la fosforilación IRS1 Tyr se caracterizan por una respuesta rápida. Lo mismo es cierto para otros blancos directos de IRS1 fosforilados en Tyr a lo largo de la cascada TSC1/2-mTOR, es decir, fosforilación AMPK en la formación de complejos T172, SHP2-IRS1 y GRB2/SOS-IRS1. La respuesta rápida se caracteriza por un rápido aumento al estado estacionario o por un exceso transitorio seguido de la condición de estado estacionario, dependiendo de la ausencia / presencia de mecanismos de retroalimentación que actúan sobre la molécula objetivo (caso 1 y 2, en azul y verde, respectivamente, en la Fig. 3). Los mecanismos que constituyen en su mayoría la vía TSC1 / 2-mTOR y que desempeñan un papel en la fosforilación Ser de IRS1 se caracterizan por una respuesta relativamente lenta que no rebasa (caso 3, naranja en la Fig. 3). Como se observó anteriormente, la vía RAS-MAPK asume en sus componentes aguas arriba una respuesta rápida, que se vuelve notablemente más lenta para los de aguas abajo (caso 4, morado en la Fig. 3).

En general, las moléculas aguas abajo de la vía, relacionadas con procesos relativamente lentos como la activación de la transcripción o la interacción con el entorno fuera de la célula, como ERK1/2 y GLUT4, se caracterizan por una respuesta lenta, mientras que las moléculas aguas arriba de la vía se caracterizan por una respuesta rápida para provocar una propagación rápida de la señal. En este contexto, la respuesta de rebasamiento seguida del retorno a un estado estacionario podría ayudar a lograr una propagación rápida de la señal en una ruta de señalización, haciendo que las moléculas vuelvan a estar disponibles para otras rutas de señalización inmediatamente después.

Predicciones de modelos en ausencia de mecanismos de control

Se realizaron varias simulaciones para investigar la robustez del sistema en dos efectos objetivo del ISP: la translocación de GLUT4 y la fosforilación ERK1/2. En particular, se analizó el papel de dos mecanismos de control principales en la regulación de los efectos objetivo:

Bucle de retroalimentación negativa P70S6K-IRS1 (línea roja en la Fig. 1);
Bucle de retroalimentación negativa ERK1/2-GRB2/SOS (línea azul en la Fig. 1);

Con este fin, se comparó el curso temporal de la respuesta de GLUT4 y ERK1/2 en presencia y ausencia de los dos mecanismos reguladores enumerados anteriormente (Fig. 4). La dinámica del ERK1/2 doblemente fosforilado se ve fuertemente afectada por los bucles de retroalimentación negativa P70S6K-IRS1 y ERK1/2-GRB2/SOS. Por otro lado, el estado estacionario y el comportamiento dinámico de GLUT4 en la membrana no se ven afectados por ERK1/2, pero se ven fuertemente afectados por el bucle de retroalimentación negativa P70S6K-IRS1, confirmando así la notable importancia de este último mecanismo de control en la determinación de la dinámica del sistema.

Es bien sabido que la resistencia a la insulina se asocia con defectos en la señalización dependiente de la IRS, lo que implica su desregulación en el inicio y la progresión de la enfermedad metabólica. Una visión emergente es que la regulación positiva / negativa de la IRS por vías autólogas se subvierte en la enfermedad por el aumento de las fosforilaciones basales y otras fosforilaciones de serina/treonina inadecuadas temporalmente, que conducen a una reducción de la captación de glucosa. La hiperinsulinemia compensatoria puede aumentar en este punto y conducir, en última instancia, a la diabetes. Aunque el IRS1 (y el IRS2) se regulan a través de un mecanismo complejo que implica la fosforilación de más de 50 residuos diferentes de serina/treonina, en nuestro modelo P70S6K-el bucle de retroalimentación negativa IRS1 parece esencial para un buen control de la captación de glucosa. La mejora del bucle de retroalimentación negativa P70S6K-IRS1 es capaz de explicar una reducción de la sensibilidad a la insulina y la captación de glucosa (Fig. 5). De manera similar (aunque también plantean la hipótesis de una retroalimentación positiva de mTOR a un residuo de serina IRS1 diferente), Brännmark et al. , utilizando un modelo mínimo de señalización de insulina, muestran que una disminución del mecanismo de retroalimentación positiva es capaz de explicar una reducción de la captación de glucosa.

Por otro lado, tanto los bucles de retroalimentación negativa P70S6K-IRS1 como ERK1/2-GRB2/SOS parecen esenciales para garantizar que el ERK doblemente fosforilado muestre un comportamiento transitorio, con un pico a los 10 minutos seguido de un retorno al estado basal. Este comportamiento ya se ha descrito en la literatura bajo estímulo insulínico y bajo estímulo del factor de crecimiento epidérmico . Una respuesta ERK transitoria impide una activación sostenida de ERK que daría lugar a una proliferación celular continua .

Análisis de sensibilidad

Para investigar más a fondo el papel de los dos mecanismos de control principales en la regulación de los efectos objetivo, se realizó un análisis de sensibilidad local aplicando una pequeña perturbación (0.1 % del valor del parámetro) a un parámetro de modelo a la vez y evaluando los cambios relativos resultantes de la translocación de GLUT4 y la fosforilación ERK1/2 (ver Métodos). Las tablas 1 y 2 muestran los coeficientes de sensibilidad de los parámetros del modelo, clasificados de acuerdo con su valor absoluto y comparados con el valor que los coeficientes asumen al eliminar los bucles de retroalimentación negativa P70S6K-IRS1 y ERK1/2-GRB2/SOS. Estos coeficientes miden el efecto global, es decir, durante la ventana de observación, de un cambio de parámetro en el resultado, es decir, la respuesta de GLUT4 y ERK. Los valores positivos / negativos significan que aumentar el valor del parámetro tiene el efecto de mejorar/reducir la respuesta. Dado que los valores absolutos pequeños significan que los cambios de parámetros no afectan significativamente el resultado, en las Tablas 1 y 2, solo se reportan coeficientes superiores al 0,1 % (valor absoluto), ya sea en el modelo original o modificado.

Tabla 1 Análisis paramétrico de sensibilidad del modelo completo para translocación de membrana GLUT4

Tabla 2 Análisis paramétrico de sensibilidad del modelo completo para la activación de ERK1/2

El análisis paramétrico de sensibilidad del modelo completo para la respuesta de GLUT4 revela que los parámetros más sensibles están relacionados con la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática, seguidos de los relacionados con la formación de lípidos y la formación/disociación del complejo IRS1_PI3K. La ausencia de retroalimentación p70S6K_IRS1 tiene un fuerte impacto en el aumento de la sensibilidad (valor absoluto) de los parámetros relacionados con la formación de lípidos y la formación/disociación del complejo IRS1_PI3K.

Los parámetros relacionados con la fosforilación/desfosforilación IRS1 basal en Tyr / Ser, tienen menor sensibilidad, lo que disminuye (valor absoluto), en general, al eliminar la retroalimentación P70S6K-IRS1, con la excepción del parámetro k7p, relacionado con la fosforilación IRS1 en Ser. Los parámetros relacionados con la fosforilación de IRS1 mediada por PKC en la Ser también muestran valores aumentados después de la eliminación de la retroalimentación P70S6K-IRS1. Dado que la eliminación de retroalimentación ERK1/2-GRB2/SOS no tiene efecto en la translocación de GLUT4, los coeficientes de sensibilidad no cambian con y sin esta retroalimentación.

El análisis paramétrico de sensibilidad del modelo completo para la respuesta ERK1/2 muestra que los parámetros más sensibles están relacionados con la activación RAS, MEK y RAF y con la fosforilación IRS1 en Tyr y Ser, esta última mediada por p70S6K.A lo largo de la vía PI3K-AKT y RAS-ERK1/2, la retroalimentación ERK1/2-GRB2/SOS parece tener un papel importante en la robustez del sistema. La dinámica del sistema se ve débilmente afectada por su ausencia (ver Fig. 4), mientras que la sensibilidad del parámetro aumenta (en valor absoluto) en casi todos los casos si se elimina esta retroalimentación.

Las conclusiones sobre el efecto de la retroalimentación P70S6K-IRS1 en la respuesta ERK1/2 son más controvertidas. La eliminación de esta retroalimentación tiene el efecto de reducir la sensibilidad de los parámetros a lo largo de la vía PI3K_AKT, mientras que, a lo largo de la vía RAS-ERK1/2, casi no tiene efecto para los parámetros relacionados con la fosforilación de MEK, la inactivación de RAF y la fosforilación de ERK. Disminuye la sensibilidad de los parámetros relacionados con la activación RAS, RAF y con la disrupción compleja IRS1-GRB2 / SOS e IRS1-SHP2. Aumenta fuertemente la sensibilidad de los parámetros relacionados con la activación de SRC y RAF.

Estos resultados destacan el papel central de los bucles de retroalimentación negativa en la determinación no solo de la dinámica de un sistema biológico, sino también de su robustez. Esta propiedad es de notable importancia porque preserva el comportamiento dinámico del sistema contra el ruido y las pequeñas fluctuaciones biológicas comúnmente debidas a la variabilidad intercelular.