Élément Agissant Cis

Facteurs se liant au promoteur proximal pro-COL1A2

Plusieurs éléments agissant cis fonctionnels ont été identifiés dans le promoteur proximal d’environ 400 pb du gène pro-Col1a2 de la souris (154-2350 pb) et la séquence minimale humaine entre 152 et 2378 pb. Le premier facteur de transcription qui s’est lié à ce promoteur a été la protéine CBF, qui se lie au CCAAT, omniprésente. Ce facteur de transcription est formé de trois sous-unités distinctes, nommées A, B et C, qui ont toutes été clonées et séquencées (Maity et de Crombrugghe, 1998). Les trois sous-unités sont nécessaires pour que le CBF se lie à la séquence contenant la boîte CCAAT située entre 284 et 280 et active la transcription dans les gènes humains et murins (voir Fig. 13.2B). Les données in vitro suggèrent que les sous-unités A et C s’associent d’abord pour former un complexe A-C et que ce complexe forme ensuite une molécule hétéromère avec la sous-unité B (Sinha et al., 1995). Des mutations dans la boîte CCAAT qui empêchent la liaison du CBF diminuent l’activité transcriptionnelle du promoteur proximal pro-Col1a2 trois à cinq fois dans des expériences de transfection transitoire de lignées cellulaires fibroblastiques (Coustry et al., 1995). Le CBF purifié ainsi que le CBF composé de ses trois sous-unités recombinantes activent également le promoteur pro-Col1a2 dans des extraits nucléaires exempts de cellules précédemment appauvris en CBF (Coustry et al., 1995). Deux des trois sous-unités de CBF contiennent des domaines d’activation transcriptionnelle. Plus récemment, une seule substitution de T à un A in vivo en présence d’un activateur amont de la séquence humaine a suggéré que le CBF est impliqué dans la structuration de l’expression du collagène de type I dans l’axe dorsoventral ainsi que dans l’axe rostrocaudal des fibroblastes cutanés de souris (Tanaka et al., 2004).

En plus du site de liaison pour le CBF, des expériences d’empreinte au pied et des études sur le gel-shift ont identifié d’autres sites de liaison dans les 350 premières pb du promoteur souris pro-Col1a2. Il a été démontré que trois séquences riches en GC, situées à environ 2160 pb (entre 2176 et 2152 pb) et 2120 pb (entre 2131 et 2114 pb) interagissent avec des protéines de liaison à l’ADN par des expériences d’empreinte et des tests de décalage de gel (Hasegawa et al., 1996). Une délétion dans le promoteur de la souris englobant ces trois séquences empreintes a complètement aboli l’activité transcriptionnelle du promoteur proximal pro-Col1a2 dans des expériences de transfection transitoire utilisant des lignées cellulaires fibroblastiques. Les régions correspondantes du promoteur humain pro-COL1A2 ont également été protégées dans des expériences d’empreintes in vivo et in vitro (Ihn et al., 1996) et des activateurs transcriptionnels liés. Cependant, des essais de déplacement de gel effectués à l’aide du promoteur humain pro-COL1A2 ont suggéré qu’un élément agissant sur le cis situé à 2160 pb représente un élément répresseur (Ihn et al., 1996), impliquant que les interactions entre les protéines interagissant avec les éléments activateurs à 2300, 2125 et 280 pb et les protéines se liant à un élément répresseur à 2160 pb régulent ce gène. Plus récemment, il a été montré que CUX1, une protéine de déplacement CCAAT, est associée à une expression réduite du collagène de type I à la fois in vivo et in vitro et que l’amélioration de l’expression de CUX1 entraîne une suppression efficace du collagène de type I en interférant avec la liaison CBF (Fragiadaki et al., 2011).

Sp1 et Sp3 se lient au motif TCCTCC situé entre 2123 et 2128 pb ; les deux facteurs de transcription activent ce promoteur (Ihn et al., 2001) (voir fig. 13.2B). De plus, les protéines qui se lient aux deux segments proximaux se lient également au segment le plus riche en GC en amont, à 2300 pb, à l’exception du CBF, suggérant une redondance entre les segments d’ADN fonctionnellement actifs du promoteur proximal pro-COL1A2.

Le TGFß médie son action dans le promoteur humain par la combinaison du facteur de transcription ubiquitaire Sp1, du complexe Smad3/4 et des coactivateurs p300/protéine de liaison CREB (CBP) dans ce qu’on appelle un élément sensible au TGFß (TßRE) (Zhang et al., 2000). Ce segment contient trois motifs riches en GC entre 2330 et 2255, capables de lier Sp1, la protéine de liaison CCAAT/enhancer (C/EBP), la protéine activatrice 1 (AP1) et les complexes Smad (Chen et al., 1999, 2000a, b; Kanamaru et coll., 2003; Tamaki et coll., 1995; Zhang et coll., 2000). L’interaction entre ces facteurs nucléaires est synergique et nécessite la liaison de Sp1 et Smad3/4 aux éléments riches en GC et au site Smad CAGAC en aval, respectivement (Ghosh et al., 2000; Poncelet et Schnaper, 2001; Zhang et al., 2000). Au tournant de ce siècle, il y a eu un grand débat sur la question de savoir si les SMAD sont plus importants que l’AP1 dans le promoteur proximal. Cela a été résolu quelque 10 ans plus tard lorsqu’il a été démontré que TGFß active également le gène COL1A2 via une voie de signalisation non canonique (indépendante de la Smad), qui nécessite une coopération enhancer / promoteur impliquant un échange d’occupation du facteur de transcription c-Jun / JunB d’un site critique enhancer, ce qui a pour résultat la stabilisation de la coalescence enhancer / promoteur (Ponticos et al., 2009). Un rapport explorant les effets de l’hypoxie et du TGFß sur le gène COL1A2 a ajouté au rôle potentiel des Smad, en particulier Smad3, dans la régulation de l’expression du collagène. Ces études sur des cellules mésangiales humaines suggèrent que dans des conditions hypoxiques et en présence de TGFß, le facteur 1α (HIF-1α) inductible par l’hypoxie et le Smad3 peuvent former des complexes transcriptionnels et améliorer préférentiellement la liaison à l’un des trois éléments de réponse à l’hypoxie au sein du promoteur COL1A2 humain à la position -335 pb (Baumann et al., 2016). Les auteurs suggèrent que cette nouvelle interaction fournit un mécanisme qui rend compte de la synergie observée entre HIF et TGFß dans la fibrose rénale.

Le TNFa et l’interféron-γ (IFN-γ) suppriment la production de matrice. Contrairement à l’élément d’ADN unique qui médie la stimulation TGFß du promoteur proximal COL1A2, il a été démontré que le TNFa et l’IFN-γ inhibent la transcription du COL1A2 en interférant avec la formation du complexe induit par le TGFß et en stimulant l’interaction de facteurs négatifs avec des éléments d’ADN réactifs situés en 5′ et 3′ de celui-ci. Cet élément dit « sensible aux cytokines » joue un rôle important dans le maintien de l’homéostasie. L’implication d’AP1 et de NF-kB dans la transduction de l’action inhibitrice du TNFa sur l’expression du gène COL1A2 a été démontrée en utilisant des fibroblastes immortalisés de souris dépourvues de l’activateur AP1 Jun N-terminal kinase 1 (JNK1) ou du modulateur essentiel NF-kB NEMO. Plus précisément, la perte de JNK1 a empêché l’antagonisme TNFa de TGFß, mais a préservé l’inhibition TNFa de l’expression constitutive de COL1A2. L’antagonisme du TGFß par le TNFa implique la phosphorylation JNK1 du c-jun, conduisant à une compétition hors ADN de cette dernière molécule pour la liaison de Smad3 au site d’ADN apparenté et/ou pour l’interaction avec les coactivateurs p300/CBP (Kouba et al., 1999; Verrecchia et coll., 2001, 2002).

La liaison de l’IFN-γ à ses récepteurs conduit à la phosphorylation tyrosine de la janus kinase (JAK) tyrosine kinases, ce qui entraîne à son tour la phosphorylation du transducteur de signal et de l’activateur de la transcription (STAT1). Dans COL1A2, l’activation de STAT1 entraîne une compétition avec Smad3 pour l’interaction avec p300/CBP (Inagaki et al., 2003). De plus, JAK1 peut également activer le facteur de liaison de la boîte Y du facteur de transcription (YB-1); cette activation entraîne à la fois l’inhibition de l’activité du promoteur constitutif par la liaison YB-1 de la boîte 2125TC et l’antagonisme des signaux TGFß par la compétition YB-1 avec Smad3 et / ou p300 / CBP (Ghosh et al., 2001; Higashi et coll., 2003). Pour plus de détails, voir « Facteurs de croissance » et « Cytokines. »

Est1 / Fli1 se lient également à la même séquence avec des effets opposés sur la transcription du collagène de type I. Un facteur de transcription Ets fonctionnel a été identifié dans COL1A2 à proximité des sites Sp1. Ets1 a stimulé, tandis que Fli1 a inhibé, l’activité du promoteur. La liaison à Sp1 était essentielle à l’inhibition de Fli1. De plus, la surexpression de Fli1 dans les fibroblastes dermiques a entraîné une diminution des taux d’ARNm et de protéines COL1A2 (Czuwara-Ladykowska et al., 2001). De plus, le traitement TGFß des fibroblastes dermiques conduit à la dissociation de l’Ets1 des complexes CBP/p300 et modifie leur réponse au TGFß en faveur de la dégradation de la matrice (Czuwara-Ladykowska et al., 2002).

De plus, il a été démontré qu’un motif CpG à 17 pb est préférentiellement méthylé et lié par des protéines RFX dans des cellules acquérant un état I–négatif au collagène. Des expériences de transfection cellulaire en conjonction avec des tests de liaison à l’ADN ont attribué des propriétés positives ou négatives à chacune des protéines se liant au promoteur proximal de pro-COL1A2 (Sengupta et al., 2002). En revanche, il a été démontré que le degré de méthylation au site 17 CpG module l’affinité de liaison des protéines RFX et, par conséquent, leur capacité à réguler à la baisse l’activité promotrice en recrutant des protéines associées qui interfèrent avec l’assemblage de complexes transcriptionnels à action positive (Xu et al., 2003, 2004).

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