Az inzulin jelátviteli út szabályalapú modellje / BMC Systems Biology

az inzulin jelátviteli út modellje

három publikált modellből kiindulva megvalósítottuk az ISP modelljét az ábrán látható módon. 1 A Rendszerbiológiai grafikus jelölés használata .

a modell számos alapvető elemet tartalmaz, amelyek felelősek az inzulin hatásáért, mivel az ISP három fő alútja, amelyeket az alábbiakban röviden ismertetünk, szerepelnek.

a PI3K-AKT útvonal

a PI3K-Akt útvonal esetében leginkább a modellre hivatkozunk Sedaghat et al. . A modellt számos kutatócsoport használta, és számos legismertebb jelátviteli komponenst tartalmaz, amelyek a GLUT4 glükóz transzporter transzlokációját közvetítik. Ezek közé tartozik az inzulinreceptor kötő és újrahasznosító alrendszerek; a poszt-receptor jelátviteli alrendszer, beleértve mind a Ser -, mind a Tyr – foszforilációt az inzulinreceptor szubsztráton1 (IRS1); komplex (IRS1_PI3K komplex) képződése a foszforilált IRS1 és a foszfatidilinozitid 3-kináz (PI3K) között; a foszfatidilinozitol 3,4,5-TRISZFOSZFÁTOK PI(3,4,5)P3, szintézis; a protein-kináz B (AKT) és protein-kináz C (PKC) foszforilációja-6.a GLUT4 transzlokációja a plazmamembránba. A modellben a protein tirozin-foszfatáz (PTP1B) és a lipid-foszfatázok (SHIP2 és PTEN) hatásait is figyelembe veszik.

a TSC1/2-mTOR útvonal

a TSC1 / 2-mTOR útvonal esetében leginkább a Sonntag et al. , leírja az mTOR hatását az inzulinra és az aminosavakra adott válaszként. A modell mind az mTOR komplexeket, mind az mTORC1-et, mind az mTORC2-t figyelembe veszi. az mtorc1 aktiváció az aminosavak jelenlététől függ, és az 1-es és 2-es Tuberous Sclerosis protein (TSC1/2) aktiváció (azaz Ser foszforiláció) gátolja, ami viszont az 5′ AMP-aktivált protein kináz (AMPK) aktivációjától függ. Az AMPK aktiválása az IRS1 Tyr foszforilációjától függ, míg a TSC1 / 2 gátlás (azaz a Tyr foszforiláció) az Akt foszforilációjától függ a Thr309-nél. mTORC2, amelyet nemrégiben ismeretlen foszfoinozitid-függő protein-kináz 2-ként (PDK2) azonosítottak, azaz. az AKT Ser474 foszforilációjáért felelős kináz hozzájárul az AKT kettős foszforilezéséhez a Thr309 foszforilezéssel együtt, amelyet a foszforinozitid-függő protein-kináz 1 (PDK1) működtet. Sonntag et al. fogalmazza meg a PI3K variáns jelenlétének hipotézisét, amelyet közvetlenül az aktivált inzulinreceptor szabályoz, viszont aktiválja az mTORC2-t. Ezt a hipotézist beépítettük a modellünkbe.

a RAS-MAPK útvonal

a RAS-MAPK útvonal esetében leginkább a modellre utalunk Boriszov et al. , leírja mind az EGF, mind az inzulin stimulációkat. A modell magában foglalja a Ras-MAPK útvonal összes fő kémiai mechanizmusát: a Tyr foszforilezett IRS1 kölcsönhatása az SHP2-vel (az SH2 domént tartalmazó tirozin protein kináz 2) és a GRB2-SOS komplex (a növekedési faktor receptorhoz kötött 2 és a hét nélküli komplex fia), így az SHP2-IRS1 és a GRB2/SOS-IRS1 komplexek; a RAS GTP-kötése; a RAF proto – onkogén szerin/treonin-protein kináz (C-RAF); az inzulinreceptor kölcsönhatása a Ras Gtpáz aktiváló fehérjével (RASGAP), amely viszont katalizálja a RAS deaktiválásának fordított folyamatát; a proto-onkogén tirozin-protein kináz SRC aktiválása, amely teljes mértékben aktiválja a c-RAF-ot; a kettős specifitás mitogén-aktivált kináz 1/2 (MEK1/2); az extracelluláris-szignálszabályozott kinázok (ERK1/2).

a PI3K-AKT, a TSC1/2-mTOR és a RAS-MAPK útvonalak integrációja

a PI3K-AKT, a TSC1/2-mTOR és a RAS-MAPK útvonalak több egymást átfedő részt tartalmaznak, amelyeket az eredeti dokumentumokban gyakran különböző módon modelleztek, kissé eltérő feltételezéseken alapulva. Összehasonlítottuk a különböző modellek átfedő reakcióit, és a celluláris biokémia jelenlegi ismeretei alapján megvalósítottuk a legmodernebb verziót. Ezenkívül a három modell integrálásához az állapotváltozók leírására alkalmazott különböző mértékegységekkel kellett foglalkozni. Míg az immunoblot kísérletek lehetővé teszik Fontos információk megszerzését a jelátviteli események időskálájáról, a fehérje expressziójával kapcsolatos kvantitatív információk gyakran problematikusak, így az előre jelzett koncentrációprofilokat néha mikromoláris koncentrációban jelentik, mint Borisov et al. , vagy tetszőleges egységekben (AU), mint a Sonntag et al. . Ellentétben, ban ben Sedaghat et al. , a koncentrációt vagy moláris egységekben, vagy a teljes koncentráció százalékában fejezték ki (pl. a GLUT4 citoszol koncentrációt a kiindulási állapotban a sejt összes GLUT4 koncentrációjának 96% – ának tekintették).

potenciálisan az RBM lehetővé teszi mind a determinisztikus, mind a sztochasztikus szimulációk elvégzését, feltéve, hogy a változók mennyiségét sejtenként molekulák másolataiban fejezzük ki. Még akkor is, ha a jelen munkában nem használtunk sztochasztikus szimulációt, az összes változót ugyanahhoz az egységhez igazítottuk, azaz. molekulák száma sejtenként, megszorozzuk a moláris egységek NA*V (NA jelzi Avogadro száma és V A sejt térfogata, egyenlőnek tekinthető 3e-12 l). Az AU-ból származó egységkonverzióra és a százalékos koncentrációkra vonatkozó összes részlet anyagban és módszerekben található.

a kapott Modell 42 reakciószabályból és 101 paraméterből áll, amelyek 61 különböző kémiai faj kölcsönhatásait kódolják. A reakciókat, a paraméterértékeket és a kezdeti feltételeket az 1.kiegészítő fájl tartalmazza.

az RBM-ISP modell újdonságai

az RBM implementációja megkönnyítette az ISP számos jellemzőjének elszámolását, mint például a jelátviteli fehérjék foszforilációját több helyen és több hatással, a molekulák egyidejű kölcsönhatását különböző kötő partnerekkel és egyes reakciók szubcelluláris lokalizációját. A fent felsorolt jellemzőket az alábbiakban részletesen tárgyaljuk.

jelátviteli fehérjék foszforilezése több helyen

a jelátviteli molekulák aktivitása eltérő lehet, attól függően, hogy mely maradékok foszforilálódnak. Vegyük például az IRS1-et és az AKT-t. Az IRS1 számos olyan szermaradékkal rendelkezik, amelyek potenciálisan részt vehetnek a poszttranszlációs módosításokban, és kinázhatásában aktiválhatók vagy gátolhatók, attól függően, hogy a foszforilált maradék Tyr vagy Ser . Például a TYR-896 foszforiláció szükséges a PI3K, SHP2 és GRB2 kötéshez, míg a Ser-636 foszforiláció a p70S6K által az inzulinrezisztenciával kapcsolatos mechanizmus . Az AKT ezzel szemben a Thr309 vagy a Ser474 foszforilezésével aktiválható a PDK1, illetve az mTORC2 által .

az IRS1 foszforilációfüggő aktiválása/gátlása már szerepelt a Sedeghat modellben, bár figyelembe véve a Ser foszforilációt, amelyet a PKC, nem pedig a p70S6K szabályoz, mint a Sonntag modellben. Itt modelleztük mind a PKC, mind a p70S6K műveleteket, és leírtuk a pIRS1-Tyr896 komplex kialakulását / disszociációját PI3K , SHP2 és GRB2-vel .

az AKT két foszforilációs helyét nem modellezték kifejezetten Sedaghat et al. . Modelleztük az AKT foszforilációját a Thr-nél, amelyet PI(3,4,5)P3 közvetített, mint Sedaghat et al. modell és az AKT foszforiláció a Ser által közvetített mTORC2, mint a Sonntag et al. modell és feltételezett:

i)
AKT vagy a Thr-en, vagy mindkét helyen foszforilálva hat a TSC1/2 komplexre azáltal, hogy közvetíti foszforilációját a Tyr-en, defoszforilációját pedig a Ser-en;
ii)
AKT foszforiláció a Ser-en vagy mindkét helyen a C-RAF inaktiválásához ;
iii)
AKT foszforilezés Thr – nél vagy Ser-nél a GLUT4 transzlokáció aktiválásához .

kölcsönhatás több kötő partnerrel

a jelátviteli útvonalakon lévő molekulák kölcsönhatása számos különböző kötő partnerrel különböző komplexek potenciális kialakulását eredményezi. Az ISP-ben a Tyr-896-nál foszforilált IRS1 képes megkötni a PI3K-t a Sedaghat et al. vagy GRB2/SOS és SHP2, mintájára Borisov et al. . Annak érdekében, hogy az RBM-ISP modell specifikációja megfeleljen a jelenlegi ismereteknek, lehetővé tettük különböző komplexek kialakítását. Így az IRS1 kölcsönösen kizáró módon kötheti a GRB2/SOS-t és az SHP2-t, de egyidejűleg kötheti a GRB2 / SOS-t és a PI85 P3K szabályozó alegységét .

információ a szubcelluláris lokalizációról a reakciószabályokban

a fehérjék kölcsönhatásának lehetősége gyakran összefügg fizikai lokalizációjukkal, azaz jelenlétükkel a sejten kívüli térben, citoplazmában, magban, plazmamembránban stb. Például a PI(3,4,5)P3 lipidek plazmamembrán dokkoló helyekként működnek, amelyek különböző pleckstrin homológiai (PH) doméneket tartalmazó fehérjéket (pl. AKT és PDK1) és ezek együttes lokalizációja felgyorsíthatja a jelátviteli eseményeket . Egy másik példa az mtorc1 kölcsönhatása az agyban dúsított Ras homológgal (RHEB) és a rag családdal a lizoszóma membránon, zoncu et al. . Modellünkben az inzulinreceptor és a GLUT4 transzporter szubcelluláris lokalizációjára vonatkozó információkat tartalmaztuk, megkülönböztetve plazmatikus és citoplazmatikus lokalizációjukat a sedaghat et al. .

modell előrejelzések

a modellt benépesítő összes kémiai faj koncentrációs profilját 60 perc, 100 nM-es inzulin stimuláció után szimuláltuk. A 100 nM-es koncentráció az inzulin stimuláció jól elfogadott szintjét képviseli az irodalomban gyakran megtalálható és csoportunk által is használt sejttenyészetekben . Szerint Sonntag et al. , feltételeztük egy állandó aminosav stimulációt is, amely szükséges az mTORC1 aktiválásához és a p70s6k visszacsatolásához az IRS1-en. A modell megbízhatóságának értékeléséhez a modell előrejelzéseit összehasonlítottuk néhány foszfoproteinre vonatkozó adatkészletünkben rendelkezésre álló kísérleti adatokkal az inzulin plusz aminosavak, azaz a leucin stimulációját követő 2., 5., 10., 30. és 60. percben. Amint az ábrán látható. A 2.ábrán látható, hogy a pAKT-S473 és a pmTORC1-S2448 kísérleti és előrejelzett profiljai jó egyezést mutatnak, mivel mindkettő növekvő foszforilációs mintázatot mutat, amely az első 2-5 perc, illetve 20-30 perc alatt eléri az egyensúlyi állapotot. A ppERK1/2-Y202,Y204 előrejelzett profilját az első 10 perc kísérleti adatai igazolják, míg az utolsó időpontokban a kísérleti adatokban gyorsan csökken a modell-előrejelzések tekintetében. A ppERK1/2-Y202,Y204 kísérleti adataiban megfigyelt profil jobban illeszkedhet a ppERK1/2-Y202, Y204 és GRB2/SOS közötti visszacsatolás erősségének növelésével. Ábra. 2 (jobb felső panel, szaggatott vonal), a ppERK1/2-Y202,Y204 szimulált profilja látható, amelyet a kcat39 paraméter (lásd az 1.kiegészítő fájlt) 10-szeres szorzatával kapunk. Vegye figyelembe, hogy az online elérhető RBM ISP modellben úgy döntöttünk, hogy a modell paraméterét változatlanul hagyjuk , azaz az irodalomból származó értéket használjuk, elhalasztva a paraméterek optimalizálását a jövőbeni tanulmányokhoz, amikor további adatok állnak rendelkezésre. Sajnos a pP70S6K-T389 kísérleti adatai nem voltak megbízhatóak (csak egy replikáció áll rendelkezésre), így nem tudjuk összehasonlítani ennek a fehérjének a kísérleti és szimulált profilját, amely az útvonal végpontja az IRS1 fontos visszacsatolási műveletével. Mindazonáltal a szimulált profil ábrán látható. A 2 .ábra (alsó, jobb oldali panel) hasonlít más dokumentumokban bemutatott kísérleti adatokra.

megvizsgáltuk az összes aktív faj előre jelzett profilját, majd dinamikai viselkedésük szerint négy csoportba csoportosítottuk őket, az ábrán látható módon. 3:

gyors válasz, az egyensúlyi állapot elérése 2-5 percen belül (kék)
gyors túllépési válasz, a csúcs elérése 2-5 percen belül, majd az egyensúlyi állapot 10-20 perc után (zöld)
lassú válasz, az egyensúlyi állapot elérése 10-20 perc alatt (narancssárga)
lassú túllövési válaszok, a csúcs elérése 5-10 perc alatt, az egyensúlyi állapot pedig 30-60 perc alatt (lila).

az inzulin stimulációt követően az inzulinreceptor gyorsan reagál foszforilációval és események kaszkádját váltja ki különböző útvonalak mentén. A PI3K-AKT útvonal mentén az IRS1 Tyr – foszforilációhoz szorosan kapcsolódó összes mechanizmust gyors válasz jellemzi. Ugyanez vonatkozik a Tsc1/2-mTOR kaszkád mentén a Tyr-nél foszforilált IRS1 egyéb közvetlen célpontjaira, azaz a T172-nél az AMPK-foszforilezésre, az SHP2-IRS1-re és a GRB2/SOS-IRS1 komplexek képződésére. A gyors választ vagy az egyensúlyi állapot gyors emelkedése, vagy egy átmeneti túllépés jellemzi, amelyet az egyensúlyi állapot követ, attól függően, hogy a célmolekulára ható visszacsatolási mechanizmusok hiányoznak/vannak-e (1.és 2. eset, kék, illetve zöld, ábra. 3). Azok a mechanizmusok, amelyek többnyire a TSC1/2-mTOR útvonalat alkotják, és szerepet játszanak az IRS1 Ser – foszforilezésében, viszonylag lassú, nem túllépő válasz jellemzi (3.eset, narancssárga ábra. 3). Amint azt fentebb megfigyeltük, a RAS-MAPK útvonal az upstream komponenseiben gyors reakciót feltételez, amely észrevehetően lassabbá válik a downstream komponenseknél (4.eset, Lila ábra. 3).

általában a viszonylag lassú folyamatokhoz, például a transzkripciós aktiváláshoz vagy a sejten kívüli környezettel való kölcsönhatáshoz kapcsolódó molekulákat, mint például az ERK1/2 és a GLUT4, lassú válasz jellemzi, míg az utat felfelé mutató molekulákat gyors válasz jellemzi, hogy gyors jelterjedést váltsanak ki. Ebben az összefüggésben a túllépési válasz, amelyet az egyensúlyi állapotba való visszatérés követ, elősegítheti a gyors jelterjedést egy jelátviteli útvonalon, így a molekulák azonnal elérhetővé válnak más jelátviteli útvonalak számára.

modelljellemzők kontrollmechanizmusok hiányában

ezután számos szimulációt végeztek a rendszer robusztusságának vizsgálatára az ISP két célhatásán: GLUT4 transzlokáció és ERK1 / 2 foszforiláció. Különösen két fő kontrollmechanizmus szerepét elemezték a célhatások szabályozásában:

P70S6K-IRS1 negatív visszacsatolási hurok (piros vonal az ábrán. 1);
ERK1 / 2-GRB2 / SOS negatív visszacsatolási hurok (kék vonal az ábrán. 1);

ebből a célból összehasonlítottuk a GLUT4 és ERK1/2 válasz időbeli lefolyását a fent felsorolt két szabályozó mechanizmus jelenlétében és hiányában (ábra. 4). A kétszeresen foszforilezett ERK1/2 dinamikáját erősen befolyásolja mind a P70S6K-IRS1, mind az ERK1/2-GRB2/SOS negatív visszacsatolási hurkok. Másrészt a GLUT4 membránon belüli egyensúlyi állapotát és dinamikai viselkedését nem befolyásolja az ERK1 / 2, de erősen befolyásolja a p70s6k-IRS1 negatív visszacsatolási hurok, ezáltal megerősítve ez utóbbi szabályozó mechanizmus figyelemre méltó jelentőségét a rendszerdinamika meghatározásában.

jól ismert, hogy az inzulinrezisztencia az IRS-függő jelátvitel hibáival jár, ami diszregulációját vonja maga után az anyagcsere-betegség megindításában és progressziójában. Egy feltörekvő nézet az, hogy az IRS autológ utak általi pozitív/negatív szabályozása a megnövekedett bazális és egyéb időben nem megfelelő szerin/treonin foszforilációk , amelyek csökkent glükózfelvételhez vezetnek. A kompenzációs hyperinsulinaemia ezen a ponton emelkedhet, és végső soron cukorbetegséghez vezethet. Bár az IRS1-et (és az IRS2-t) egy komplex mechanizmus szabályozza, amely több mint 50 különböző szerin/treonin maradék foszforilációját foglalja magában, modellünkben a P70S6K-IRS1 negatív visszacsatolási hurok elengedhetetlennek tűnik a glükózfelvétel megfelelő szabályozásához. A p70s6k-IRS1 negatív visszacsatolási hurok javítása képes megmagyarázni a csökkent inzulinérzékenységet és a glükózfelvételt (ábra. 5). Hasonlóképpen (bár feltételezik az mTOR pozitív visszajelzését egy másik IRS1 Szerinmaradékra is), br Xhamnnmark et al. , az inzulin jelátvitel minimális modelljének felhasználásával mutassa meg, hogy a csökkent pozitív visszacsatolási mechanizmus képes megmagyarázni a csökkent glükózfelvételt.

másrészt mind a P70S6K-IRS1, mind az ERK1/2-GRB2/SOS negatív visszacsatolási hurkok elengedhetetlennek tűnnek annak garantálásához, hogy a kétszeresen foszforilezett ERK átmeneti viselkedést mutasson, amelynek csúcsa 10 perc, majd visszatér a alapállapot. Erről a viselkedésről már beszámoltak a szakirodalomban az inzulin stimulus és az epidermális növekedési faktor stimulus alatt . Az átmeneti ERK válasz megakadályozza az ERK tartós aktiválódását, amely folyamatos sejtproliferációt eredményezne .

érzékenységi elemzés

a célhatások szabályozásában a két fő kontrollmechanizmus szerepének további vizsgálatához helyi érzékenységi elemzést végeztünk egy kis perturbáció alkalmazásával (0.A paraméterérték 1% – A) egy modellparaméterre egy időben, és a GLUT4 transzlokáció és ERK1/2 foszforiláció relatív változásainak értékelése (lásd a módszereket). Az 1.és 2. táblázat a modellparaméterek érzékenységi együtthatóit mutatja, abszolút értékük szerint rangsorolva, és összehasonlítva azzal az értékkel, amelyet az együtthatók a p70s6k-IRS1 és ERK1/2-GRB2/SOS negatív visszacsatolási hurkok eltávolításakor feltételeznek. Ezek az együtthatók a paraméterváltozásnak az eredményre, azaz a GLUT4 és az ERK válaszra gyakorolt összhatását mérik, azaz a megfigyelési ablak alatt. A pozitív / negatív értékek azt jelentik, hogy a paraméterérték növelése fokozza/csökkenti a választ. Mivel a kis abszolút értékek azt jelentik, hogy a paraméterváltozások nem befolyásolják szignifikánsan az eredményt, az 1.és 2. táblázatban csak a 0,1% – nál nagyobb együtthatót (abszolút érték) jelentik, akár az eredeti, akár a módosított modellben.

1. táblázat a GLUT4 membrán transzlokáció teljes modelljének paraméteres érzékenységi elemzése

2. táblázat az ERK1 / 2 aktiválás teljes modelljének paraméteres érzékenységi elemzése

a GLUT4 válasz teljes modelljének paraméteres érzékenységi elemzése azt mutatja, hogy a legérzékenyebb paraméterek a GLUT4 plazmamembránba történő transzlokációjával kapcsolatosak, majd a lipidképződéssel és az IRS1_PI3K komplex képződéssel/disszociációval kapcsolatosak. A p70s6k_irs1 visszacsatolás hiánya erősen befolyásolja a lipidképződéssel és az IRS1_PI3K komplexképződéssel/disszociációval kapcsolatos paraméterek érzékenységének (abszolút értékének) növelését.

a kiindulási IRS1 foszforilációhoz/defoszforilációhoz kapcsolódó paraméterek a Tyr/Ser-nél alacsonyabb érzékenységgel rendelkeznek, ami általában csökken (abszolút érték) a P70S6K-IRS1 visszacsatolás eltávolításával, kivéve a K7P paramétert, amely az Irs1 Foszforilációjához kapcsolódik a Ser-nél. A PKC által közvetített IRS1 foszforilációval kapcsolatos paraméterek a Ser-nél szintén megnövekedett értékeket mutatnak a P70S6K-IRS1 visszacsatolás eltávolítása után. Mivel az ERK1 / 2-GRB2/SOS visszacsatolás eltávolítása nincs hatással a GLUT4 transzlokációra, az érzékenységi együtthatók nem változnak ezzel a visszacsatolással vagy anélkül.

az ERK1/2 válasz teljes modelljének paraméteres érzékenységi elemzése azt mutatja, hogy a legérzékenyebb paraméterek a Ras, a MEK és a RAF aktiválásához, valamint az Irs1 Foszforilációjához kapcsolódnak Tyr és Ser esetén, ez utóbbit a p70S6K közvetíti.mind a PI3K-AKT, mind a RAS-ERK1/2 út mentén az ERK1/2-GRB2/SOS visszacsatolás fontos szerepet játszik a rendszer robusztusságában. A rendszer dinamikáját gyengén befolyásolja annak hiánya (Lásd az ábrát. 4), míg a paraméter érzékenysége szinte minden esetben növekszik (abszolút értékben), ha ezt a visszacsatolást eltávolítják.

a P70s6k-IRS1 visszajelzések ERK1/2 válaszra gyakorolt hatásáról szóló következtetések ellentmondásosabbak. A visszacsatolás eltávolítása a PI3K_AKT útvonal mentén csökkenti a paraméterek érzékenységét, míg a RAS-ERK1/2 útvonal mentén szinte nincs hatása a MEK foszforilációval, RAF inaktiválással és ERK foszforilációval kapcsolatos paraméterekre. Csökkenti az érzékenységet a RAS, a RAF aktiválás, valamint az IRS1-GRB2/SOS és az IRS1-SHP2 komplex zavarokkal kapcsolatos paraméterekre. Erősen növeli az SRC és RAF aktiválással kapcsolatos paraméterek érzékenységét.

ezek az eredmények rávilágítanak a negatív visszacsatolási hurkok központi szerepére nemcsak a biológiai rendszer dinamikájának, hanem robusztusának meghatározásában is. Ez a tulajdonság figyelemre méltó jelentőséggel bír, mivel megőrzi a rendszer dinamikus viselkedését a zaj és a kis biológiai ingadozások ellen, amelyek általában az intercelluláris variabilitás miatt következnek be.

az inzulin jelátviteli út szabályalapú modellje