a pro-COL1A2 proximális promoterhez kötődő tényezők
számos funkcionális cisz hatású elemet azonosítottak az egér pro-Col1a2 génjének körülbelül 400 bp proximális promoterében (154-2350 bp) és az emberi minimális szekvenciában 152 és 2378 bp között. Az első transzkripciós faktor, amely ehhez a promóterhez kötődik, a mindenütt jelenlévő CCAAT-kötő fehérje CBF volt. Ezt a transzkripciós faktort három különálló alegység alkotja, a, B és C néven, amelyeket mind klónoztak és szekvenáltak (Maity and De Crombrugghe, 1998). Mindhárom alegységre szükség van ahhoz, hogy a CBF kötődjön a 284 és 280 között elhelyezkedő CCAAT dobozt tartalmazó szekvenciához, és aktiválja a transzkripciót mind az emberi, mind az egér génekben (Lásd az ábrát. 13.2 B). Az In vitro adatok arra utalnak, hogy az A és C alegységek először egy A–C komplexet alkotnak, majd ez a komplex heteromer molekulát képez a B alegységgel (Sinha et al., 1995). Mutációk a CCAAT dobozban, amelyek megakadályozzák a CBF kötődését, csökkentik a pro-Col1a2 proximális promoter transzkripciós aktivitását három-öt alkalommal a fibroblasztikus sejtvonalak tranziens transzfekciós kísérleteiben (Coustry et al., 1995). A tisztított CBF, valamint a három rekombináns alegységből álló CBF szintén aktiválja a PRO-Col1a2 promótert sejtmentes nukleáris kivonatokban, amelyek korábban kimerültek a CBF-ből (Coustry et al., 1995). A CBF három alegysége közül kettő transzkripciós aktivációs doméneket tartalmaz. Újabban a T egyetlen in vivo A-val történő helyettesítése az emberi szekvencia upstream fokozójának jelenlétében azt sugallta, hogy a CBF részt vesz az I. típusú kollagén mintázásában expresszió a dorsoventral-ban, valamint az egérbőr fibroblasztjainak rostrocaudalis tengelye (Tanaka et al., 2004).
a CBF kötőhelyén kívül lábnyomvizsgálatok és géleltolásos vizsgálatok más kötőhelyeket is azonosítottak az egér pro-Col1a2 promoter első 350 bp-jében. Három, körülbelül 2160 bp (2176 és 2152 bp között) és 2120 bp (2131 és 2114 bp között) GC-ben gazdag szekvenciáról kimutatták, hogy lábnyomkísérletekkel és géleltolódási vizsgálatokkal kölcsönhatásba lépnek a DNS-kötő fehérjékkel (Hasegawa et al., 1996). A deléció az egér promóterben, amely magában foglalja ezt a három lábnyomott szekvenciát, teljesen megszüntette a pro-Col1a2 proximális promoter transzkripciós aktivitását fibroblasztikus sejtvonalakat alkalmazó tranziens transzfekciós kísérletekben. A humán pro-COL1A2 promoter megfelelő régiói szintén védettek voltak in vivo és in vitro lábnyomozási kísérletekben (Ihn et al., 1996) és kötött transzkripciós aktivátorok. Az emberi pro-COL1A2 promóter alkalmazásával végzett géleltolódási vizsgálatok azonban azt sugallták, hogy a 2160 bp-n elhelyezkedő cisz-hatású elem represszor elemet képvisel (Ihn et al., 1996), ami azt jelenti, hogy a 2300, 2125 és 280 bp aktivátor elemekkel kölcsönhatásba lépő fehérjék és a 2160 bp-nél egy represszor elemhez kötődő fehérjék közötti kölcsönhatások szabályozzák ezt a gént. Újabban kimutatták, hogy a CUX1, a CCAAT elmozdulási fehérje, az I. típusú kollagén csökkent expressziójával társul mind in vivo, mind in vitro, és hogy a CUX1 expressziójának fokozása az I. típusú kollagén hatékony szuppresszióját eredményezi a CBF kötődésének megzavarásával (Fragiadaki et al., 2011).
kimutatták, hogy az Sp1 és az Sp3 megköti a 2123 és 2128 bp közötti tcctcc motívumot; mindkét transzkripciós faktor aktiválja ezt a promótert (Ihn et al., 2001) (Lásd az ábrát. 13.2 B). Ezenkívül a két proximális szegmenshez kötődő fehérjék a leginkább upstream GC-ben gazdag szegmenshez is kötődnek, 2300 bp-nél, a CBF kivételével, ami redundanciára utal a Pro-COL1A2 proximális promoter funkcionálisan aktív DNS-szegmensei között.
a TGF a humán promóterben a mindenütt jelenlévő SP1 transzkripciós faktor, a Smad3/4 komplex és a P300/CREB-kötő fehérje (CBP) koaktivátorok kombinációján keresztül közvetíti hatását az úgynevezett TGF-re reagáló elemben (t) (Zhang et al., 2000). Ez a szegmens három GC-ben gazdag motívumot tartalmaz 2330 és 2255 között, amelyek képesek az Sp1, a CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP), az activator protein 1 (AP1) és a Smad komplexek (Chen et al.,1999, 2000A, b; Kanamaru et al., 2003; Tamaki et al., 1995; Zhang et al., 2000). Ezen nukleáris tényezők közötti kölcsönhatás szinergikus, és megköveteli az Sp1 és az Smad3/4 kötődését a GC-ben gazdag elemekhez, illetve a downstream CAGAC Smad helyhez (Ghosh et al., 2000; Poncelet and Schnaper, 2001; Zhang et al., 2000). A századfordulón nagy vita folyt arról, hogy a SMAD-ok fontosabbak-e, mint az AP1 a proximális promóterben. Ez körülbelül 10 évvel később megoldódott, amikor kimutatták, hogy a TGF a C1a2 gént egy nem kanonikus (Smad-független) jelátviteli úton is aktiválja, amelyhez enhancer/promoter együttműködésre van szükség, amely magában foglalja a C-Jun/JunB transzkripciós faktor foglaltságának cseréjét egy kritikus enhancer hely, ami az enhancer/promoter koaleszcencia stabilizálódását eredményezi (Ponticos et al., 2009). A hypoxia és a TGF által a Col1a2 génre gyakorolt hatásokat vizsgáló jelentés hozzáadta a SMAD-ok, különösen az Smad3 potenciális szerepét a kollagén expresszió szabályozásában. Ezek a humán mesangialis sejteken végzett vizsgálatok azt sugallják, hogy hipoxiás körülmények között és TGF jelenlétében a hypoxia által indukálható 1-es faktor (HIF-1!) és az Smad3 transzkripciós komplexeket képezhet, és előnyösen fokozhatja a humán COL1A2 promoter három hipoxia válaszelemének egyikéhez való kötődést -335 bp pozícióban (Baumann et al., 2016). A szerzők azt sugallják, hogy ez az új kölcsönhatás olyan mechanizmust biztosít, amely megmagyarázza a HIF és a TGF között megfigyelt szinergiát a vesefibrózisban.
a TNFa és az interferon-6 (IFN-6) gátolja a mátrixtermelést. A kol1a2 proximális promóter TGF-et stimuláló egyetlen DNS-elemmel szemben kimutatták, hogy mind a TNFa, mind az IFN-ons gátolja a COL1A2 transzkripciót azáltal, hogy megzavarja a TGF-indukált komplex kialakulását, és stimulálja a negatív tényezők kölcsönhatását az 5′ és 3′ – ban elhelyezkedő reagáló DNS-elemekkel. Ez az úgynevezett “citokinre reagáló elem” fontos szerepet játszik a homeosztázis fenntartásában. Az AP1 és az NF-kB részvétele a TNFa gátló hatásának transzdukciójában a COL1A2 gén expresszióján olyan egerekből származó immortalizált fibroblasztok alkalmazásával mutatták ki, amelyekből hiányzik az AP1 aktivátor Jun N-terminális kináz 1 (JNK1) vagy az NF-kB esszenciális Modulátor NEMO. Pontosabban, a jnk1 elvesztése megakadályozta a TGF-ek TNFa-antagonizmusát, de megőrizte a konstitutív COL1A2 expresszió TNFa-gátlását. TGF a TNFa által okozott tnk1 antagonizmus magában foglalja a c-jun JNK1 foszforilációját, ami az utóbbi molekula DNS-en kívüli versenyéhez vezet az smad3 kötődéséhez a rokon DNS-helyhez és/vagy a P300 / CBP koaktivátorokkal való kölcsönhatáshoz (Kouba et al., 1999; Verrecchia et al., 2001, 2002).
az IFN-ons receptorokhoz való kötődése a janus-kináz (JAK) tirozin-kinázok tirozin-foszforilációjához vezet, ez pedig jelátalakítót és transzkripciós aktivátort (STAT1) eredményez foszforiláció. A COL1A2-ben a STAT1 aktiválás versenyt eredményez az Smad3-mal a P300/CBP-vel való interakcióért (Inagaki et al., 2003). Ezenkívül a JAK1 aktiválhatja az Y-box kötési faktor (YB-1) transzkripciós faktort is; ez az aktiválás mind a konstitutív promoter aktivitás gátlását eredményezi a 2125TC box YB-1 kötésén keresztül, mind a TGF-jelek antagonizmusát az YB-1 smad3-mal és/vagy p300/CBP-vel való versenyén keresztül (Ghosh et al., 2001; Higashi et al., 2003). További részletekért lásd: “növekedési faktorok “és” citokinek.”
az Est1/Fli1 szintén kimutatták, hogy ugyanazt a szekvenciát köti, ellentétes hatással az I. típusú kollagén transzkripcióra. Funkcionális Ets transzkripciós faktort azonosítottak a COL1A2 – ben az Sp1 helyek közvetlen közelében. Az Ets1 stimulálta, míg a Fli1 gátolta a promoter aktivitást. Az Sp1 kötődés elengedhetetlen volt a Fli1 gátlásához. Ezenkívül a fli1 túlzott expressziója a dermális fibroblasztokban a COL1A2 mRNS és a fehérje szintjének csökkenéséhez vezetett (Czuwara-Ladykowska et al., 2001). Ezenkívül a dermális fibroblasztok TGF-kezelése az Ets1 disszociációjához vezet a CBP / p300 komplexektől, és megváltoztatja a TGF-re adott válaszukat a Mátrix degradáció javára (Czuwara-Ladykowska et al., 2002).
továbbá kimutatták, hogy a CpG motívum 17 bp-nél előnyösen metilezett és RFX fehérjék kötődnek a kollagén I-negatív állapotba kerülő sejtekben. A sejttranszfekciós kísérletek a DNS-kötő vizsgálatokkal együtt pozitív vagy negatív tulajdonságokat tulajdonítottak a pro-COL1A2 proximális promoteréhez kötődő fehérjék mindegyikéhez (Sengupta et al., 2002). A metiláció mértéke a 17 CpG helyén viszont kimutatták, hogy modulálja az RFX fehérjék kötési affinitását, következésképpen képességüket a promóter aktivitás csökkentésére olyan kapcsolódó fehérjék toborzásával, amelyek zavarják a pozitív hatású transzkripciós komplexek összeszerelését (Xu et al., 2003, 2004).