Fluoreszcens képalkotás

Bevezetés

a szövetek, sejtek és a sejteken belüli kisebb struktúrák (organellák) többnyire víz, ezért átlátszóak. Az apró, átlátszó vízzsákok leképezése olyan képeket eredményez, amelyek nem tartalmaznak sok információt, és a mikroszkópiában létfontosságú, hogy legyen valamilyen kontraszt vagy folt, amely színt ad a minta területeinek, és sokkal könnyebben láthatóvá teszi őket. Ezenkívül mi van, ha csak a sejt belsejében lévő kisebb struktúrákat szeretné ábrázolni, például egy magot vagy egy sejtmembránt? A teljes cella színezése lehetetlenné tenné az érdeklődő területek lokalizálását.

a fluoreszcencia mind a kontraszt, mind a lokalizáció kérdéseit megoldja. A fluoreszcencia az, ahol egy tárgy fényt bocsát ki a fény elnyelése után. Számos különböző tárgy mutat fluoreszcenciát, például ásványi anyagok (a fluoreszcencia szó a fluorit ásványból származik), mélytengeri halak (leghíresebb medúza Aequorea victoria, amelyből zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) fedeztek fel), növények, vegyi anyagok és még sok más.

fluoreszcens molekulákat (más néven fluorofórokat) használnak a minták címkézésére, és olyan fluorofórok állnak rendelkezésre, amelyek gyakorlatilag bármilyen színű fényt bocsátanak ki. Fluoreszcens mikroszkópban a mintát fluoroforral jelölik, majd erős fényt (gerjesztő fényt) használnak a minta megvilágítására, amely fluoreszcenciát (emissziós fényt) bocsát ki. Ily módon a minták erősen ellentétesek a fekete háttérrel, mivel a fluorofor élénk színű fényt bocsát ki. Ezeknek a fluoroforoknak az érdeklődési területre történő lokalizálásával világos képet lehet készíteni a sejt bármely részéről, így a fluoreszcens mikroszkópia hatékony eszköz az élettudományok számára.

Brightfield vs fluoreszcens képalkotás

brightfield mikroszkópiában a mintát átvitt fehér fénnyel világítják meg. Ez a minta egyenletes megvilágítását eredményezi a mikroszkóp alatt, hogy megfigyelje az erősen kontrasztos, festett vagy természetesen pigmentált mintákat. A brightfield azonban nem elegendő az átlátszó/áttetsző, festetlen sejtek vagy sejtszerkezetek megkülönböztetéséhez az érdekes folyamatok tanulmányozásához.

a fluoreszcens mikroszkópia fluoroforok, molekulák használatán alapul, amelyek meghatározott látható hullámhosszú fényt bocsátanak ki, ha más hullámhosszú fénynek vannak kitéve. Amikor ezek a fluoroforok egy célzott érdekes struktúrához kötődnek, a fluoroforból kibocsátott fotonok felhasználhatók ennek az érdekes struktúrának a megjelenítésére. A fluoreszcens mikroszkópia előnye, hogy a megcélzott struktúrák világítanak, míg a minta nem kívánt területei alig vagy egyáltalán nem fluoreszcensek, lehetővé téve a könnyű célzást és képalkotást.

miért fluoreszkálnak a molekulák

a fluoreszcencia eredete az aktív fluorofor körül szabadon mozgó elektronok, amelyek elnyelt energiát szabadítanak fel, amint az az ábrán látható.2.

gerjesztés előtt az elektronok a rendelkezésükre álló legalacsonyabb energiaállapotban vannak-az alapállapotban (S0). Amikor egy elektront egy bizonyos energiatartományú fotonnal ütnek meg, az elektron elnyeli a foton energiáját, és magasabb energiájú állapotba ugrik (S1, S2 vagy S3). Az alapállapotba való visszatéréshez (S0) az elektron felszabadítja a további energiát egy foton kibocsátásaként. Ennek a fotonnak az energiája kisebb, mint a gerjesztési energia, tehát hosszabb hullámhosszú. Ez az oka annak, hogy az emissziós fény hullámhossza hosszabb, mint a gerjesztő fényé, és más színben jelenhet meg.

a kibocsátott foton általában a látható spektrumban van, és mikroszkóp alatt megtekinthető, ha elegendő gerjesztett fluorofór van. A kibocsátott foton hullámhossza minden fluorofóra specifikus, és ez a kiszámíthatóság lehetővé teszi a könnyű fluoreszcencia képalkotást.

fluoreszcencia intenzitási tényezők

míg a fluoroforok kiszámítható hullámhosszú fluoreszcenciát bocsáthatnak ki, fontos tudni, hogy mely tényezők szabályozzák a fluoreszcencia intenzitását. Elég intenzív fénykibocsátás nélkül a fluoreszcencia nem lesz kimutatható mikroszkóppal.

Kvantumhozam

a fluorofor kvantumhozama (6) a felszabadult fotonok számának az abszorbeált fotonok számához viszonyított aránya. A kvantumhozamot gyakran 0-1 értékként fejezik ki, amely 1 A fotonkonverzió 100% – os hatékonysága. Fontos megjegyezni azt is, hogy minden fluorofórnak egyedi pH-ja, Ionos szilárdsága és hőmérséklete van az optimális fluoreszcencia hatékonyság érdekében.

kihalási együttható

minden fluorofor eltérő képességgel rendelkezik a fotonok elnyelésére, még akkor is, ha azok megfelelő hullámhossztartományban vannak a gerjesztéshez. Ha egy fluorofor olyan fotonnak van kitéve, amely megfelel a gerjesztési hullámhosszának, akkor annak a valószínűsége, hogy egy foton elnyelődik, mérhető jellemző, amelyet kihalási együtthatónak (MHz) neveznek.

a fluorofor kvantumhozama és kihalási együtthatója gyakran együtt jelenik meg annak leírására, hogy a fluorofor milyen fényesnek bizonyult kísérleti körülmények között.

fluoreszcencia élettartam

amikor egy fluorofor elektron elnyel egy fotont, nem bocsát ki azonnal hosszabb hullámhosszú fotont. Bizonyos energia felszabadulása a gerjesztett energiaállapotok között ismert, hogy különböző hosszúságú időt vesz igénybe. Az az idő, amelyet egy elektron gerjesztett állapotban tölt, mielőtt felszabadítja a fotont, és visszatér az alapállapotba, a fluoreszcencia élettartamának mérése. Minden fluorofor élettartama egyedi, és kísérletileg mérhető. Fluoreszcens festékek kísérleti használata esetén hasznos az élettartamuk szempontjából, különösen olyan alkalmazásokhoz, amelyek nagy sebességet igényelnek, például kalcium képalkotó neuronok.

gerjesztési hullámhossz-intenzitás

a legtöbb fluoreszcens mikroszkópos beállítás olyan fényforrást tartalmaz, amely beállítható a kívánt hullámhossz-tartomány kiadására. Számos fluoreszkáló fényforrás beállítható a gerjesztés intenzitására is, hogy növelje a fényúton mozgó fotonok számát. Fluoreszcensen jelölt mintában, amely gerjesztési hullámhosszának van kitéve, minden fluorofor nem aktiválódik egyszerre. A gerjesztés intenzitásának növelésével és a mintát elérő fotonok számának növelésével nagyobb a valószínűsége annak, hogy több fluorofor gerjesztődik.

Fotostabilitás

a Fotostabilitás egy molekula vagy szervezet azon képessége, hogy ellenálljon a károsodásnak. A fluoreszcens mikroszkópia során a fluoroforok végül abbahagyják a közeledő fotonok elnyelését, és állandó sötét állapotba kerülnek. Ahogy egy szervezet több fluorofórt gyűjt össze sötét állapotban, a jelölt célpont megjelenése csökken, és a minta állítólag fotobleaching. A fluoreszcens mikroszkópia során gyakran lépéseket tesznek a kísérlet során tapasztalt fényfehérítés mennyiségének csökkentésére. Néhány intézkedés magában foglalja a mintával kölcsönhatásba lépő fény intenzitásának csökkentését, valamint olyan speciális fluoreszcens festékek használatát, amelyek nem maradnak aktívak mindaddig, amíg más színezékek.

fluoreszcens mikroszkópia

a kutatók számára a fluoreszcencia fő előnye a fluoreszcens mikroszkópia alkalmazásának képessége, ahol a mintákat fluoreszcens anyaggal, például festékkel, antitesttel vagy fehérjével jelölik/festik, lehetővé téve a képek kontrasztját. Ezeket a fluoreszkáló címkéket megcélozva a kutatók kiválaszthatják, mit akarnak látni. Ezt mutatja az ábra.3, ahol egy neuron jól látható az asztrociták között, mivel azokat különböző színű fluoreszcens marker jelöli.

általában a fluoreszcens mikroszkópia esetében a mintát fluoreszcens markerekkel jelölik (általában a minta bizonyos részeire jellemzőek). A mintát ezután megvilágítják a fluorofor specifikus gerjesztési hullámhosszával, majd a kapott emissziós fluoreszcenciát a detektor, általában egy érzékeny tudományos kamera veszi.

a legtöbb fluoreszcens mikroszkóp epifluoreszcens mikroszkóp, ahol a gerjesztés és az emisszió ugyanazon a fénypályán történik. Mind a gerjesztés megvilágítása, mind a kibocsátott fluoreszcencia áthalad a mikroszkóp objektívjén, és általában szűrjük annak érdekében, hogy csak a fluoreszcenciát észleljük. Ez a Beállítás ábrán látható.4.

Autofluoreszcencia

egyes struktúrák, biológiai organizmusok és általános mikroszkópos minták természetesen fluoreszcenciát mutathatnak, amelyet autofluoreszcenciának neveznek. Ez különbözik a jelölt minták fluoreszcenciájától, de gyakran hasonló hullámhosszúságú, ami azt jelenti, hogy az autofluoreszcens mikroszkópos minták elhomályosíthatják a mesterségesen hozzáadott fluoreszcenciát, és megzavarhatják a detektálást, csökkentve a jelet. Fontos tudni, hogy a minták autofluoreszcenciát mutatnak-e, mivel ez befolyásolja a fluoreszcencia képalkotást, kivéve, ha meghatározott hullámhosszokat használnak annak elkerülésére.

az autofluoreszcens objektumok gyakori példái a mitokondriumok, a lizoszómák, a kollagén és néhány aminosav, például a triptofán, a tirozin és a fenilalanin. Leginkább az autofluoreszcencia gyakori a növényekben, mivel klorofillt és más fluoreszcens molekulákat, például lignineket és karotinokat használnak. Fig.Az 5. ábra az autofluoreszcencia különböző színeit mutatja egy jelöletlen skót fenyőmintából.

Összefoglalás

az első fluoreszcens festék bevezetése óta a fluoreszcens mikroszkópiát a hagyományos brightfield mikroszkópos technikáknál magasabb specifikációjú sejtek és sejtszerkezetek megjelenítésére használják. A kutatók manipulálhatják a struktúrát, az optikai tulajdonságokat és az érdeklődésre számot tartó befolyásoló kísérleteket a releváns adatok megszerzése érdekében. Ez a rugalmasság lehetővé tette a fluoreszcens mikroszkópia bevonását számos élettudományi kísérletbe.

a minta és a fluorofor típusától függően a legjobb képalkotó eredmények elérése érdekében gondosan kell kiválasztani egy tudományos kamerát.

1. Fénymikroszkópia. (2009) Természeti Mérföldkövek. MacMillan Publishers Limited, 6-22.
2. Lavis, L. D., & Raines, R. T. (2008). Világos ötletek a kémiai biológiához. ACS Kémiai Biológia, 3(3): 142-155.
3. Liu, Y., Lilly, D. (2017) kristályszerkezetek, ha a cianin-Fluoroforok a kettős szálú RNS végére halmozódnak. Biofizikai Folyóirat, 113, (11): 2236-2343.
4. Berezin, M. Y., Achilefu, S. (2010). Fluoreszcencia élettartam mérések és biológiai képalkotás. Kémiai Vélemények, 110 (5): 2641-2684.
5. Stockert, J., Blazquez-Castro, A. (2017) fluoreszcens mikroszkópia az élettudományokban. Sharjah, Egyesült Arab Emírségek. Bentham Tudományos Kiadó.
6. Berezin, M. Y., & Achilefu, S. (2010). Fluoreszcencia élettartam mérések és biológiai képalkotás. Kémiai Vélemények, 110 (5): 2641-2684.
7. Denk, W., Strickler, J., Webb, W. (1990). Két Foton Lézeres Letapogató Fluoreszcens Mikroszkópia. Tudomány. 248, (1951): 73-76.
8. Tehát, P. (2002). Kétfoton fluoreszcens Fénymikroszkópia. Macmillan Publishing Group.
9. Schermelleh, L., Heinztmann, R. és Leonardt, H. (2010). Útmutató a szuperfelbontású fluoreszcens Mikroszkópiához. A Sejtbiológiai folyóirat 190 (2): 165-175.
10. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., LippincottSchwartz, J., Hess, H. F. (2006) intracelluláris fluoreszcens fehérjék képalkotása nanométer felbontásban. Tudomány. 313(5793): 1642-5
11. Rust, M. J., Bates, M. & Zhuang, X. (2006) Szubdiffrakciós határkép sztochasztikus optikai rekonstrukciós mikroszkóppal (STORM). Nat Módszerek. 2, (10):793-5.
12. Rego, E., Shao, L., Macklin, J. Winoto, L., Johansson, G., Kamps-Hughes, N., Davidson, M. és Gustasson, M. (2010) PNAS. 109 (3): e135-a143.
13. Jungmann, R., Avenda GmbH, M. S., Woehrstein, J. B., Dai, M., Shih, W. M. & Yin, P. (2014) multiplexelt 3D sejtes szuperfelbontású képalkotás DNS-festékkel és csere-festékkel. Nat Módszerek. 11(3): 313-318
14. Jiang, X., Wang, L., Carroll, S., Chen, J., Wang, M. és Wang, J. (2018) Challenges and Opportunities for Small Molecule Fluorescent Probes in Redox Biology Applications. Antioxidants & Redox Signaling. Mary Ann Liebert, Inc.