Kétdimenziós poliakrilamid gélelektroforézis (2D-oldal): előrelépések és perspektívák

Bevezetés

az elmúlt 25 évben, különösen az elmúlt évtizedben, fokozott erőfeszítéseket tettek olyan technológiák kifejlesztésére, amelyek képesek azonosítani és számszerűsíteni a sejtrendszerben expresszált nagyszámú fehérjét (azaz a proteomot) a betegség biomarkereinek kimutatása, a fehérje áramkörök feltérképezése vagy az új foszforilációs helyek azonosítása reményében. A proteom összetettsége a hatékony elválasztás és a fehérjék érzékeny kimutatásának módszereinek kifejlesztését tette ezen erőfeszítés kritikus elemévé. A tömegspektrometria (MS) technológiájának folyamatos fejlődése lehetővé tette a fehérjék kimutatását a korábban lehetségesnél sokkal nagyobb sebességgel és érzékenységgel. Még a legmodernebb MS sem képes jellemezni az összes komponenst egy komplex proteomban. A tudósok “oszd meg és uralkodj” megközelítést alkalmaznak a proteomok jellemzésére, mivel megpróbálják időben korlátozni a tömegspektrométer által elemzett fehérjék számát. A proteom elterjesztésével végül több fehérjét elemeznek egy egyedi kísérlet során.

a proteomok szétválasztásához a tudósok elektroforetikus és kromatográfiás technológiákat alkalmaztak külön-külön és kombinációban, offline és online egyaránt. Bár ezek az erőfeszítések több ezer fehérje elválasztását és azonosítását eredményezhetik, egyetlen módszer sem képes feloldani a proteom összes fehérjéjét, nagy számuk és koncentráció-dinamikus tartományuk miatt. Az egydimenziós elválasztások nem megfelelőek a komplex fehérje keverékek hatékony feloldásához. Ezt a tényt több mint fél évszázaddal ezelőtt elismerte Smithies és Poulik (1), akik felismerték, hogy két elektroforetikus folyamat kombinációja egy gélen derékszögben sokkal nagyobb felbontást biztosít, mint ami külön-külön lehetséges. A két elektroforetikus folyamat a molekulaméret szerinti felbontás és a keményítőgélen történő szabad oldatmobilitás. Előrejelzésük továbbra is igaznak bizonyult, és megalapozta az ortogonális többdimenziós módszerek kidolgozását a komplex keverékek elválasztására nemcsak gélelektroforézissel, hanem kromatográfiával és kapilláris elektroforézissel is.

ahhoz, hogy megfelelően megértsük a kétdimenziós oldal (2D-oldal) előrehaladását, sokkal messzebbre kell mennünk, mint egy negyed évszázad. 1930-ban Tiselius bevezette a mozgó határ módszerét, mint analitikai eszközt a fehérjék elektroforézisének tanulmányozására (2). Úttörő munkája óta az elektroforézis különféle formáit alkalmazták a fehérjék komplex keverékeinek elválasztására, mindegyik jobb felbontással. Raymond és Aurell (3) már 1962-ben kimutatta a gélkoncentráció szignifikáns nemlineáris hatását a fehérjék elektroforetikus mobilitására 2-D elektroforézis alkalmazásával, különböző akrilamid gélkoncentrációkat alkalmazva a szérumfehérjék elválasztására. Két évvel később Raymond (4) bizonyította a lapos födémgélek fölényét a hengeres csőgélekhez képest. Például a lapos födém maximális felületet biztosít a gél hűtéséhez; a kapott mintákat könnyebb számszerűsíteni standard felvételi denzitométerekben; nagyszámú minta feldolgozható egyetlen géllemez segítségével, megkönnyítve az azonos körülmények között feldolgozott minták közvetlen összehasonlítását; és ami a legfontosabb, a lapos födém lehetővé teszi 2-D elválasztások alkalmazását. Ezek az éleslátó preferenciák igaznak bizonyultak,és ma már számos bioanalitikai laboratóriumban gyakorolják.

a 2-D gélelválasztás további előrelépését 1972-ben Wright (5) vezette be, aki az első dimenzióban egy 4,75% – os (2% – os keresztkötésű) poliakrilamid géloszlopot használt, amelyet ezután eltávolítottak az üveghengerből, és egy 2% – os gradiens lemez felső szélére fektettek. Elektroforézist követően a géllemezt festőoldatba helyeztük, amelynek eredményeként 112 oldott humán szérumfehérjét jelenítettünk meg.

ezek az új megközelítések csak kis számú fehérjét oldottak meg, elsősorban a sejt vagy a szérum proteom leggyakoribb fehérjéit. A 2D-oldal bevezetése 1975-ben O ‘ Farrell (6) a sejtfehérjék denaturálási körülmények közötti elválasztására több száz fehérje felbontását tette lehetővé. Az alkalmazott elv nagyon egyszerű volt: a fehérjéket gélen oldottuk izoelektromos fókuszálás (IEF) alkalmazásával, amely az első dimenzióban elválasztja a fehérjéket izoelektromos pontjuk szerint, majd elektroforézis következik egy második dimenzióban nátrium-dodecil-szulfát (SDS) jelenlétében, amely molekulatömegük szerint választja el a fehérjéket. O ‘ Farrell módszere valóban a modern 2D-oldal alapja, amelyet más kutatók gyorsan adaptáltak és széles körben elfogadtak. Anderson és Anderson (7) 2D oldalt használtak az emberi plazmafehérjék elemzéséhez. Körülbelül 300 különböző fehérjefoltot tudtak elkülöníteni és kimutatni a festés után. Ellentétben O ‘ Farrell, Manabe (8) elválasztott humán plazmafehérjék segítségével 2D-oldal denaturáló szerek nélkül. Körülbelül 230 fehérjefoltot lehetett megfigyelni a gélen, azonban a foltok elkenődtek és nem oldódtak meg jól.

immobilizált pH-gradiensek bevezetése

mint fentebb említettük, a 2D-oldal az IEF-t tartalmazza az első dimenzióban, majd az SDS-oldal a második dimenzióban. A Kolin 1954-es bevezetése óta (9) az IEF számos előrelépésen ment keresztül. Az első dimenziót üveg vagy műanyag csövekben képződő poliakrilamid gélrudakban hajtják végre, amelyek ampholitokat tartalmaznak, amelyek pH-gradienst képeznek egy elektromos mezőben. Ezek a rudak történelmileg reprodukálhatatlanok, instabilak és nehéz velük dolgozni. Az immobilizált pH-gradiensek (IPG-k) bevezetése Bjellqvist et al. (10) jelentős hatással volt az IEF-nek a komplex keverékek széles pH-tartományban történő elkülönítésére történő alkalmazására. Az IPGs lehetővé tette stabil és reprodukálható pH-gradiensek kialakulását, amelyek képesek a savas és bázikus fehérjéket egyetlen gélre fókuszálni, széles pH-gradiensekkel. Az IPG-kben a hordozó ampholyták akrilamid molekulákhoz kapcsolódnak, és a gélekbe öntik, hogy rögzített pH-gradienst képezzenek. A gradiens rögzítése megakadályozza a gél sodródását, és biztosítja, hogy hatékonyan és reprodukálható módon önthetők legyenek. A keskeny tartományú IPG csíkok használata nagyobb számú fehérje elválasztását tette lehetővé, mint ami a standard 2D-oldal esetén lehetséges volt, mert a szűkebb pH-tartomány nagyobb fizikai távolságra volt elosztva. Ez a terjedés lehetővé tette a hasonló izoelektromos pont (pI) értékű fehérjék nagyobb felbontással történő elválasztását. Ennek szemléltetésére, Hoving et al. kifejlesztett egy 2D-oldalas módszert, amelyben keskeny tartományú IPG csíkokat alkalmaztak az első dimenzióban (11). Az IPG csíkok jellemzően 1-3 pH U szélesek voltak, és legalább 0,5 pH U átfedésben voltak egymással. A B-lymphoma sejtvonalból származó fehérjéket minden csíkra felvittük, majd IEF segítségével elválasztottuk. Ezután minden csíkot egy egyedi SDS-oldal géllemezre vittünk, majd a fehérjéket a molekulatömegük alapján a második dimenzióban elválasztottuk. Körülbelül 5000 különböző foltot detektáltunk a hat IPG csík segítségével, szemben az 1500 folttal, amelyet egyetlen IPG csík segítségével detektáltunk 3-10 pH-tartományban és egyetlen szabványos 2D-oldalas géllemezzel. Wildgruber et al. (12) 3 IPG csík használatát hasonlította össze a 4-5, 5-6 és 5,5–6,7 pH-tartományú gélekkel a 3-10 és 4-7 pH-gradiens tartományú IPG csíkokkal. Három szűk tartományú IPG csík segítségével 2,3, illetve 1,6-os több fehérjefoltot tudtak kimutatni, mint a két szélesebb gradiens tartományú IPG csíkkal (3-10, illetve 4-7).

míg a több egymást átfedő keskeny IPG-vel elérhető nagyobb felbontás lehetővé teszi több fehérje azonosítását, minden keskeny csíkhoz külön géllemezre van szükség, és mindegyikre bizonyos mennyiségű azonos mintát kell betölteni. Ez a követelmény azt jelenti, hogy ha a minta térfogata vagy koncentrációja korlátozott, előfordulhat, hogy ilyen kísérlet nem lehetséges. Korlátozott minták esetén szélesebb pH-tartományt vagy az IPG-k minimális számát kell figyelembe venni.

kétdimenziós differenciál gélelektroforézis (2D-DIGE)

a fehérjék elválasztásának célja 2D-oldal használatával kettős: (i) új fehérjék azonosítása és (ii) relatív bőségük mérése összehasonlító minták között. A 2D-oldal mint elválasztási technika egyik előnye, hogy nemcsak nagyszámú fehérjét old meg, de ezeknek a fehérjéknek a festése lehetővé teszi a fehérjék relatív bőségének számszerűsítését. Például a két (egészséges és beteg) szérummintából kivont fehérjéket külön géllemezre töltik. A festés után a fehérjefoltokat összehangolják és szkennelik, hogy megmérjék az egyéni intenzitásukat. Míg a szoftverbeigazító eszközök terén számos előrelépés történt, kihívást jelentett a két különálló gél közötti közvetlen helyszíni összehasonlítás biztosítása. A 2-D differenciál gélen belüli elektroforézis (DIGE) kifejlesztése 1997-ben legyőzte ezt a korlátozást azáltal, hogy lehetővé tette akár három különálló fehérje keverék elválasztását egyetlen 2D-oldalas gélen belül (13). Egy tipikus 2D-DIGE kísérletben a három különböző mintából-egészséges, beteg és belső kontroll-kivont fehérjéket (az egészséges és beteg mintákból kivont fehérjék azonos mennyiségének összekeveréséből álló összesített mintát) kovalens jelöléssel látják el, mindegyik cianin fluoreszcens festékkel, amelynek eltérő gerjesztési és emissziós hullámhossza van. A minták migrációja megegyezik, így ugyanaz a fehérje, amelyet bármelyik festékkel megjelöltek, ugyanabba a helyzetbe vándorol a gélen. Az alkalmazott cianin színezékek a következők: 1-(5-karboxi-pentil)-1′-propilindokarbacyanin halogenid N-hidroxiszukcinimidil-észter(Cy3); 1-(5-karboxipentil)-1′-metilindodikar-bacianin-halogenid N-hidroxiszukcinimidil-észter(Cy5); és 3 – (4-karboximetil)fenilmetil-3′ – etiloxakarbacyanin-halogenid N-hidroxiszukcinimidil-észter (cy2). A különböző címkével ellátott fehérjék és a kontrollminta azonos koncentrációját összekeverjük, egyetlen géllemezre visszük fel, és 2D-oldal segítségével elválasztjuk. A kontrollminta belső standardként szolgál, lehetővé téve mind a gélen belüli, mind a gélen belüli illesztést. A kontrollmintának tartalmaznia kell a kísérlet összes mintájában jelen lévő összes fehérjét. Ez azt jelenti, hogy a kísérletben szereplő minden fehérje egyedi jellel rendelkezik a belső standardban, amelyet az egyes géleken belüli közvetlen mennyiségi összehasonlításokhoz használnak, valamint az egyes fehérjék mennyiségi abundancia-értékeinek normalizálására a gélek között. A gél szkennelése az egyes festékek specifikus gerjesztési hullámhosszain fluoreszcens képalkotó segítségével lehetővé teszi a differenciálisan jelölt fehérjék megjelenítését (1.ábra). A képeket ezután egyesítik és elemzik képalkotó szoftver segítségével, amely lehetővé teszi a fehérjék abundancia szintjei közötti különbségek összehasonlítását. A DIGE értéke kiküszöböli a gél eltérésével kapcsolatos hibákat, és biztosítja a pontos mennyiségezést (14).

a kérdéses fehérjéket kivágják a gélből, proteolitikusan emésztik, és SM segítségével azonosítják. Mivel egyetlen géllemezzel hajtják végre, a 2D-DIGE 50% – kal kevesebb gélt igényel, ami gazdaságosabbá teszi, és a fehérje expressziójának különbségeit két különböző fehérjeminta között könnyebb összehasonlítani és pontosabban leképezni. Ezenkívül kevesebb időre van szükség a fehérjefoltok kimutatásához, mivel a Dige-ben a címkézési reakció gyorsabb, mint a festési módszerekkel történő vizualizáció. Amikor két különböző minta fehérje expressziós szintjének összehasonlítására van szükség, a DIGE a választott módszer (15).

a 2D-oldal erősségei és gyengeségei

az elektroforézis olyan bevett technika, amely számos előrelépésen ment keresztül, amelyek fokozták a felbontást, a detektálást, a kvantálást és a reprodukálhatóságot. A 2-D SDS-PAGE és a 2D-DIGE megközelítések a fehérje profilozáshoz hozzáférhető és gazdaságos módszerek, amelyek nagy felbontóképességgel rendelkeznek, és lehetővé teszik több száz fehérje kimutatását egyetlen géllemezen. Bár a reprodukálhatóság problémát jelentett a 2D-oldal esetében, különösen két fehérjekeverék profilozásakor, a 2D-DIGE alkalmazásával jelentősen javult. A felbontást javította az IPG-k bevezetése, amelyek lehetővé teszik az elemző számára, hogy szűk pH-gradiens tartományú ultrazoom gélek segítségével testre szabja a pH-gradienst a maximális felbontáshoz. A modern 2D-oldal esetén nem szokatlan két olyan fehérje feloldása, amelyek pI-ben különböznek 0,001 U.

bár a 2D-oldalt korlátozta az a képesség, hogy nem képes feloldani a túl bázikus vagy túl savas, túl nagy vagy túl kicsi fehérjéket, ez a korlátozás folyamatosan csökken. Például a bázikus fehérjék elválasztását IPG-k segítségével lehet elemezni a 4-12 pH-tartományban. A szétválasztás tudománya folyamatosan fejlődik, és nem sokkal később a gélelektroforézis fennmaradó kérdései megfelelően megoldódnak.

a 2D-DIGE bevezetése óriási mértékben hozzájárult a reprodukálhatóság és a mennyiségi problémák megoldásához. A képalkotók és számítógépek használata nem csak gyors adatbányászatot, adatgyűjtést és elemzést tesz lehetővé, hanem helyszíni észlelést, normalizálást, fehérje profilozást, háttérkorrekciókat, valamint az adatok jelentését és exportálását is lehetővé teszi. Elválasztási, detektálási és kvantitatív technikaként a 2D-DIGE fontos eszköz, különösen a fehérje expressziós szintjének meghatározásában és a betegség biomarker felfedezésében részt vevő klinikai laboratóriumok számára. Amikor a minták közötti abszolút biológiai variáció a fő cél, mint a biomarker felfedezésében, a 2D-DIGE a választott módszer.

míg jelentős előrelépés történt a nongel (vagy megoldás-alapú) módszerekben a frakcionálási módszerek összekapcsolására közvetlenül online MS elemzéssel, a 2D-oldal továbbra is népszerű technika a proteomikus vizsgálatok elvégzéséhez. Bár a 2D-oldalnak, mint minden frakcionálási sémának, megvannak az előnyei és hátrányai, nem kétséges, hogy a proteomok jellemzésének alapvető technikája marad még sok évig.