C Methyleringsmidler
krydsfølsomheden af visse bakteriestammer over for UV-bestråling og det monofunktionelle alkyleringsmiddel MMS, i modsætning til de hidtil diskuterede forbindelser, synes ikke at skyldes en lignende anerkendelse af punktafgiftspligtige skader af den samme endonuklease, der genkender thymindimerer i DNA. Eksistensen af bakterielle mutanter, der er følsomme over for MMS, er umiddelbart bevis for eksistensen af reparationsmekanismer i den vilde type, men det ser nu ud til, at det ikke i sig selv er en alkyleret base, der genkendes af en reparationsmekanisme, men sandsynligvis en enkeltstrengsbrud i DNA. Efter MMS-behandling blev B. subtilis inaktiveret ved dannelsen af enkeltstrengede brud i DNA, som det blev vist, vildtype B. subtilis kan reparere (Strauss og VHL, 1964; Prakash og Strauss, 1970); en MMS-følsom mutant var imidlertid mangelfuld eller manglede i denne kapacitet. Desuden blev det hævdet, at den observerede krydsfølsomhed over for UV-eller røntgenstråler kunne redegøres for dannelsen af enkeltstrengede pauser, der vides at være dannet af disse sidstnævnte midler.
bekræftelse af dette synspunkt blev opnået ud fra egenskaberne af en B. subtilis-mutant, der var følsom over for UV-bestråling, men ikke for MMS (Searashi og Strauss, 1965). Denne methylering af DNA-Baser, snarere end MMS-induceret strengbrud, fremkalder ikke nogen udskæring reparation i B. subtilis blev også tydeligt demonstreret ved manglende observation af ethvert signifikant tab af methylgrupper fra DNA af vildtype eller følsomme celler i flere cellegenerationer. Dette fund indikerede cellernes kapacitet til at replikere methyleret DNA og er i overensstemmelse med den replikative kapacitet af DNA modificeret ved arylalkylering (Venitt og Tarmy, 1972).
ovenstående undersøgelse om reparation af MMS-induceret methyleringsskade i B. subtilis kan derfor kontrasteres med andre undersøgelser af reparation af alkyleringsskader indført af det monofunktionelle methyleringsmiddel MNNG (lovley og Orr, 1970) i E. coli B/r. det adskiller sig fra MMS ved at producere en mærkbart højere andel af O 6-methylguaninrester i alkyleret DNA. Dette produkt såvel som 3-methyladenin og muligvis nogle uidentificerede produkter (oprindelsesmateriale på papirkromatogrammer) synes at være selektivt udskåret sammenlignet med tab af N −7-methylguanin fra DNA fra E. coli b/r-celler under betingelser, der tillader både vækst og DNA-syntese. 3-Methyladenin og O 6-methylguanin, men ikke oprindelsesmaterialet, blev også udskåret fra Bs–1-celler, men muligvis med en reduceret hastighed. Det blev ikke anført, om der var nogen forskel i overlevelse af MNNG-behandlede b/r–og Bs-1-celler, hvilket kunne indikere, at sådanne forskelle i udskæringskapacitet afspejler driften af en DNA-reparationsmekanisme, der hjælper celleoverlevelse. Imidlertid, Kondo et al. (1970) rapporterede ingen øget dødelighed eller øget mutationsfrekvens i E. coli, for stammer, der ikke er i stand til at punge pyrimidindimerer, efter behandling med MNNG sammenlignet med MMS. Dette til trods for, at alkylering af DNA ved MNNG producerer 20 gange mængden af O 6-methylguanin, end der produceres ved alkylering af DNA ved MMS., 1971–1972).
bevis for, at dette “tab” af 3-methyladenin og O 6-methylguanin medieres af en forskellig fra en UV-endonuklease, er kommet fra in vitro-undersøgelser af egenskaberne af et endonuklease II, isoleret fra E. coli (Friedberg og Goldthvait, 1969). Dette er i stand til at bryde phosphodiesterbindinger i DNA, der er blevet omsat med alkyleringsmidlet MMS og genkende depurinerede steder i DNA. For nylig blev det vist at frigive o 6-methylguanin og N 3-methyladenin, men ikke N 7-methylguanin fra DNA, der var blevet methyleret af kræftfremkaldende MNU (Kirtikar og Goldthvait, 1974). Endonuklease II har derfor klart mange forskellige funktioner, hvoraf den ene synes at være i stand til at adskille glycosidbindinger bundet til visse substituerede puriner. På den anden side kan det muligvis være en blanding af f.eks. Eksistensen af et stof, der på lignende måde er i stand til at udføre denne postulerede spaltning af N-glykosidbindinger (og derfor kaldet en N-glykosidase) er for nylig blevet isoleret fra E. coli og vist sig at frigive fri uracil fra DNA-holdige DEAMINEREDE cytosinrester (Lindahl, 1974). Det resulterende depurinerede sted kan derefter genkendes og repareres af et andet tilknyttet system (jf. Verly og Pakette, 1972). Specificitet af et E. coli-præparat er også blevet observeret for 3-alkyladenin, men ikke for 7-alkyladenin af Papirmeister et al. (1970). 3-Ethyladenin og O 6 −ethylguanin, men ikke n-7-ethylguaninrester i DNA dannet ved reaktion af N-ethyl-n-nitrosourea, har vist sig at være ligeledes udskåret fra E. coli VP2 DNA (1975). Udskæring af de mindre produkter af purinalkylering er nu blevet observeret i pattedyrsceller in vivo, og desuden er nedsat udskillelseskapacitet i visse væv blevet korreleret med målorganets identitet for nogle alkylerende kræftfremkaldende stoffer (se senere afsnit i,C, i Del B).
den tilsyneladende mangel på genkendelse og udskæring af N 7-alkylguaninrester i DNA ved hjælp af en reparationsmekanisme, som det fremgår af undersøgelserne af Prakash og Strauss (1970) og af lovley og Orr (1970), var også tydeligt i undersøgelser af Kimball et al. (1971a) om virkningerne af MMS og MNNG i Haemophilus influensae. Det er derfor noget overraskende, at den samme rest ser ud til at blive anerkendt i Euglena gracilis. Efter methylering med N-methyl-N-nitroso-p-toluensulfonat blev 7-methylguanin tabt fra DNA med en halveringstid på 10 timer (Olson og McCalla, 1969), hvilket er mærkbart kortere end halveringstiden på cirka 5 dage for spontan hydrolyse ved pH 7,4 i citronsyre-phosphatbuffer (Margison et al., 1973). Desuden udskærede en resistent mutantstamme tilsyneladende N-7-methylguaninen hurtigere end den følsomme stamme med udseendet af mononukleotider fra nedbrudt DNA i cellesupernatanten (Olson og McCalla, 1969). Dette uventede fund fortjener derfor yderligere undersøgelse. Disse fund, derefter, sammen med den lille indikation af et hurtigere tab af 7-methylguanin fra rottelever DNA in vivo bemærket af Margison et al. (1973), men ikke af Craddock (1973a), kan antyde, at denne DNA-substituent kan genkendes af et reparationssym under visse omstændigheder.
tabel vi opsummerer de foregående eksempler på tab af kemiske produkter fra bakterielt DNA.