Lipometabolisme Og Glykometabolisme I Leversykdommer

Abstrakt

leveren er det viktigste metabolske organet i kroppen, spesielt i lipometabolisme og glykometabolisme. Karbohydrater og fett lidelser kan føre til insulinresistens i leveren. Metabolsk ubalanse kan også føre til livstruende tilstander. Derfor er det viktig å opprettholde den normale metabolske funksjonen i leveren. Når leveren er i en patologisk tilstand, er levermetabolismen homeostase skadet, og metabolske forstyrrelser vil ytterligere forverre leversykdom. Følgelig er det viktig å bestemme forholdet mellom leversykdommer og metabolske forstyrrelser. Her vurderer vi mye bevis på at leversykdommer er nært knyttet til lipometabolisme og glykometabolisme. Selv om forstyrrelsen i levermetabolismen skyldes forskjellige leversykdommer, bestemmes brudd på metabolsk balanse av endringer i levertilstanden. Vi diskuterer forholdet mellom leversykdom og metabolske endringer, skisserer prosessen med hvordan metabolske endringer reguleres av leversykdommer, og beskriver hvilken rolle metabolske endringer spiller i prosessen og prognosen for leversykdom.

1. Innledning

leveren er det største organet i kroppen og regulerer hovedsakelig karbohydrat og lipidmetabolisme. Den unormale metabolismen av karbohydrater og fett på grunn av ubalanse i levermetabolisme kan resultere i insulinresistens i insulinfølsomme vev som leveren. En ubalanse i levermetabolismen kan skyldes sykdommen som forårsaker leverdysfunksjon. Flere metabolitter av karbohydrater og fett kan også føre til livstruende tilstander. Som en konsekvens er det viktig å opprettholde den normale metabolske funksjonen i leveren.

2. Metabolisme Av Viktige Stoffer i Leveren

2.1. Lipometabolisme

en viktig funksjon av leveren er lipidmetabolisme. Lipidinntak, forestring, oksidasjon og sekresjon av fettsyrer finner sted i hepatocytter. Triglyserider leveres til leveren for lipidmetabolisme og absorberes av leverceller, som reguleres AV LDL-reseptorer (low density lipoprotein) og LRP (LDL-reseptorrelaterte proteiner) . Overflødig karbohydrater kan omdannes til lipider i leveren under regulering av transkripsjonsfaktorer som SREBP1, ChREBP og LXR som refereres til som de novo fettsyresynteseveien .

når hepatisk lipidmetabolismehomeostase er skadet, akkumuleres triglyserider patologisk i leverceller på grunn av oppregulering av triglyseridsyntese, redusert lipiddråpedbrytning og nedsatt triglyserid og svært LDL (VLDL) sekretorisk funksjon . Dysregulering av hepatisk lipid metabolisme homeostase vil til slutt resultere i fettlever. Mekanismen som er involvert i utviklingen av ikke-alkoholisk fettleversykdom (NAFLD) til ikke-alkoholisk steatohepatitt (NASH), leverfibrose, levercirrhose og leverkreft er fortsatt uklart. Ekstedt m og Angulo P fant at fibrose bidro til utvikling av kronisk leversykdom hos PASIENTER MED NAFLD . Selv om leverfibrose skyldes overdreven aktivering av hepatiske stellatceller( HSCs), reguleres prosessen av lipidmetabolisme . Derfor er det avgjørende å opprettholde normal lipidmetabolisme homeostase for den sunne biologiske funksjonen i leveren.

2.2. Glycometabolism

leveren spiller også en betydelig rolle i sukker metabolisme, som er ansvarlig for dannelse og lagring av glukose. Etter matforbruk resulterer glukosemetabolismen i leveren i en rask transformasjon fra glukosesyntese til glukoselagring og reguleres av insulin, en nøkkelregulator . Insulin bidrar til glukoselagring ved å aktivere glykogensyntase som medierer syntesen av hepatisk glykogen. Når utskillelsen av insulin er utilstrekkelig, hemmeres syntesen av hepatisk glykogen. Dette illustreres ved hepatisk glykogensyntese hos pasienter med type 1 diabetes og et normalt kosthold, som bare er 1/3 av det hos friske personer . Den biologiske funksjonen til insulin er avhengig av koordinering av intracellulære signalveier. Insulin kan aktivere IRTK( insulinreseptortyrosinkinase), som medierer fosforyleringen AV ATP for å stimulere metabolismen av glukose i forbindelse MED PDK1 og mTORC2. Insulin kan også nedregulere glykogenrelaterte enzymer og inaktivere glykogensyntasekinase som reduserer produksjonen av glukose i leveren.

2.3. Forholdet Mellom Glukosemetabolismen Og Lipidmetabolismen

sukkermetabolismen er nært knyttet til lipidmetabolismen. Insulinresistens er vanligvis ledsaget av leversteatose. Når insulinresistens oppstår, undertrykkes lipolyse og lipidsyntese økes på grunn av effekten av hyperinsulinemi. Unormal lipidmetabolisme, spesielt akkumulering av ektopiske lipider, er nært forbundet med insulinresistens. Samuel VT fant at den hemmende effekten av insulin på leverglukoneogenese var signifikant redusert . Diacylglycerol er et produkt av lipolyse, som kan aktivere PKC for å svekke insulinsignalet. Raddatz k fant at selv om fettinnholdet i leveren økte, reduserte nivået av insulinresistens betydelig i Høyt fettmatet Prkce (et kjernegen som fremmer lipolyse for å oppregulere diacylglycerolinnhold) knockout-mus . Ektopisk lipidakkumulering i leveren kan aktivere relaterte veier som regulerer insulinfunksjonen, noe som resulterer i redusert glukoseopptak og hepatisk glykogensyntese in vivo. Akkumuleringen av ektopisk lipid øker transporten av glukose til leveren og stimulerer de novo lipidsyntese som kan føre til hyperlipidemi. I tillegg, i et metabolsk og inflammatorisk miljø forårsaket av lipidakkumulering, økes makrofager i hvitt fettvev som fremmer forestring av fettsyrer og induserer hyperlipidemi. Makrofager kan også regulere lipolyse, noe som resulterer i transport av fettsyrer til leveren og akkumulering av acetyl-CoA i leveren. Acetyl-CoA er en sterk aktivator av pyruvatkarboksylase, som kan fremme transformasjonen av glyserol til glukose kjent som glukoneogenese .

når leveren er i en patologisk tilstand, er levermetabolismen homeostase skadet, og metabolske forstyrrelser vil ytterligere forverre leversykdom. Følgelig er det viktig å bestemme forholdet mellom leversykdommer og metabolske forstyrrelser.

3. Store Leversykdommer

3.1. Hepatisk Steatose

Hepatisk steatose Er en av de viktigste sykdommene som påvirker menneskers helse over hele verden. NAFLD sykelighet er ca 25% . Når levercelleskade, betennelse og fibrose oppstår, blir enkel hepatisk steatose omdannet TIL NASH som er en høy risikofaktor for utvikling av hepatocellulært karsinom (HCC) . Når lipidmetabolismen er unormal, forstyrres balansen mellom lipidsammensetningen i celler. På grunn av den patologiske akkumuleringen av lipider resulterer utviklingen av lipotoksisitet i dysfunksjon av organeller, noe som fører til celledysfunksjon og til og med død. Signalgjenkjenning og transduksjon i celler avhenger av normal lipidmetabolisme. Lipider tilstede i cellemembraner og cytoplasma kan modifiseres direkte av cellekinaser for å regulere celleadferd . Triglyserider er hovedkomponentene i lipiddråper, og hvis innholdet av triglyserider i lipiddråper er høyt eller lavt, kan dette føre til lipidmetabolismeforstyrrelser. Papazyan r fant at når syntesen av triglyserider ble redusert ved å hemme diacylglycerolacylase, ble oksidativt stress, betennelse, fibrose og celleskader forverret til tross for en reduksjon i leversteatose . Perilipin-5 regulerer lagring av triglyserider i lipiddråper. Hvis uttrykket av perilipin-5 er nedregulert, fører dette til patologisk lipolyse og lipotoksisitet selv om lipiddråpene er små . Følgelig er det gunstig for helsen at triglyserider lagres i en inert lagringsmodus for å forhindre utvikling AV NASH fra NAFLD. Studien Av Raichur s viste et interessant fenomen, hvor en signifikant økning i ceramidinnhold ble observert i en musemodell AV NASH . Ceramid er en intermediær metabolitt av sfingolipid som kan oppreguleres ved høy ekspresjon av proinflammatoriske faktorer. Ceramid kan akselerere progresjonen av leversteatose til NASH på grunn av fremme av betennelse ved interaksjon med TNF-α. Når uttrykket av ceramid er nedregulert, kan komplikasjoner som fettlever, celleskader og insulinresistens i NASH-modellen lindres.

Lipotoksisitet er ikke bare skadelig for celler under regulering av inflammatoriske mekanismer, endoplasmatisk retikulumspenning og reaktive oksygenarter( ROS), men påvirker også organellers biologiske funksjoner. De viktigste organellene som påvirkes er mitokondrier og endoplasmatisk retikulum . Studier har vist at økning av nivået av autofagi i leveren i den ikke-alkoholholdige fettlevermodellen kan eliminere polarisasjon og skadede mitokondrier . DENNE prosessen reduserer ATP forbruk og produksjon av frie radikaler som er forårsaket av omvendt funksjon av mitokondriell ATP syntetase. I kontrast, hvis mitokondriell autofagi undertrykkes, vil alvorlig lever mitokondriell skade og hepatisk steatose utvikle seg . Mitokondriell autofagi spiller derfor en viktig rolle i reduksjonen av hepatisk steatose og hemming AV progresjonen AV NAFLD til NASH. I tillegg til mitokondriell autofagi kan leversteatose også forårsake endringer i mitokondriell dynamikk. Overdreven fettakkumulering kan direkte føre til mitokondriell skade . Nakagawa h fant at endoplasmatisk retikulumspenning spiller en viktig rolle i utviklingen AV nash fra hepatisk steatose. Når nivået av endoplasmatisk retikulumspenning ble forbedret hos mus, oppstod åpenbare nash-egenskaper i hepatocytter, som ballongdegenerasjon, inflammatorisk infiltrasjon og brobygging av «netted» fibrose. Når hepatisk steatose har utviklet SEG TIL NASH, kan den raskt utvikle seg til en leveradenom og til slutt føre TIL HCC .

i tillegg til lipotoksisitet er «glukosetoksisitet» forårsaket av glukosemetabolismeforstyrrelser involvert i patogenesen AV NASH. Overflødig karbohydrater aktiverer fettsynteseveien som reguleres av acetyl-CoA-karboksylase, SCD-1 og fettsyresyntase for å forverre hepatisk steatose. Fruktose kan øke ekspresjonen AV CD36 og er assosiert med de novo lipidsynteserelaterte proteiner som ChREBP for å fremme lipidsyntese . Overflødig glukose og fruktose kan regulere uttrykket Av ChREBP og SREBP1c direkte. I tillegg kan fruktose også forbedre nedstrøms fettsyntesegenet for å fremme akkumulering av lipider. Softic s bekreftet at hepatisk steatose hos mus ble forverret etter hemming av fruktosemetabolismen. Forekomsten av hepatisk steatose var også signifikant økt hos mennesker med fruktosemetabolismeforstyrrelser .

3.2. Hepatisk Fibrose

de fleste kroniske leverskader kan utvikle seg til leverfibrose som er nært knyttet til aktivering av HSCs. Prosessen ved hvilken hscs aktiveres innebærer transformasjon Av HSCs fra statisk tilstand I vitamin a lipiddråper til den lette fibrøse tilstanden . Hsc-ene i den lettede fibertilstanden kan transdifferensiere til myofibroblaster og produsere overflødig ECM (ekstracellulær matriks) som er ansvarlig for leverfibrose. I denne prosessen vil det intracellulære vitamin A gå tapt. Leverfibrose er en effektiv indikator på leverrelaterte komplikasjoner og spesifikke leversykdommer. Leversykdom kan føre til vitamin a homeostase svekket og føre til vitamin a-mangel til slutt. Lipolyse kan stimulere aktiveringen Av HSCs som kan fremme utskillelsen av ekstracellulær matriks og akselerere prosessen med leverfibrose . Hepatisk steatose på lang sikt kan utvikle seg til leverfibrose. Kolesterol er en bekreftet endogen aktivator AV lxr (lever x-reseptor) som ikke bare kan regulere lipometabolisme og glykometabolisme, men også modulere aktiveringen av HSCs . I tillegg til å senke kolesterolopptaket, forhindrer LXR utviklingen av leverfibrose. Beaven, S. W Et al. funnet at musene som mangler LXRa og LXRß er lettere å utvikle leverfibrose . Det har vist seg at lipiddråpeassosiert protein RAB18 spiller en viktig rolle i metabolismen av vitaminer og kolesterol . Lipid metabolisme lidelse kan føre til nedregulering AV PPAR og / eller dysfunksjon AV PPAR. PPAR kan reversere Prosessen Med hscs-aktivering og forhindre utvikling av leverfibrose ved å nedregulere uttrykket av fibrogen cytokiner utskilt Av HSCs. Studier har vist at hemming AV PPAR kan øke risikoen for å lide leverfibrose og aktivering AV PPAR kan redusere leverskade og leverfibrose . Det er rart at uttrykket AV BMP6 (benmorfogenetisk protein) er oppregulert I NAFLD, men ikke i andre leversykdommer. I studien in vitro er det funnet AT BMP6 hemmer aktiviteten Til HSCs og reduserer ekspresjonen av det fibrotiske genet . Det må være en sammenheng mellom lipidmetabolisme og BMP6-aktivering, men den spesifikke mekanismen er ikke klar. Makrofager spiller en viktig rolle i utviklingen av leverfibrose fordi den har åpenbar forbedring av leverfibrose etter utmattelse av makrofager . Under metabolsk forstyrrelse kan CCL2 og MCP-1 aktivere fibroblastrelaterte makrofager som fagocytter, Kupffer-celler og makrofager indusert av monocytter som resulterer i oppregulert metabolsk betennelse . Denne prosessen med cellerekruttering forverrer den kroniske inflammatoriske reaksjonen i leveren. Mononukleære celler kan utskille fibrotiske faktorer som TGF-β og PDGF . Disse fibrotiske faktorene oppregulerer ikke bare monocyttinducerte makrofager, men fremmer også differensiering Av HSCs i myofibroblaster. Ovennevnte prosess er hovedkilden til ekstracellulær matriks, spesielt kollagen, i leverfibrose forårsaket av kronisk betennelse . Il-1-og TNF-veiene kan forlenge overlevelsestiden Til HSCs som reguleres av mononukleære celler . Kazankov K analyserte makrofagmarkører hos mer enn 300 pasienter med hepatisk steatose. Han fant at nivået av makrofagaktivering er nært knyttet til graden av leverfibrose og sykdom . Lipidmetabolisme deltar også i aktiveringen av makrofager . Adipocytokiner spiller flere roller i progresjonen FRA NAFLD til levercirrhose. Leptin fremmer leverfibrose, men adiponektin forhindrer fremdriften av leverfibrose . Leptin kan oppregulere uttrykket For Asma, Type 1 Kollagen og TGFß. Hedgehog pathway som er nært forbundet med leverfibrose er regulert av lipid . Hedgehog-banen kan aktivere HSCs for å forvandle den til prolifererende myofibroblast. NÅR NAFLD utvikler SEG TIL NASH hvis patologiske trekk er leverfibrose, er uttrykket Av Hedgehog signifikant oppregulert . Hedgehog signalvei er også involvert i lipidsyntese og sukkerutnyttelse . Guy CD fant at Når Hedgehog-signalveien undertrykkes, kan akkumuleringen av muskelfibroblaster i leveren reduseres .

3.3. Hepatocellulært Karsinom

Selv om de viktigste risikofaktorene for HCC er HBV-og HCV-infeksjon, reduseres HCC indusert av virusinfeksjon årlig på grunn av utviklingen av effektive hepatitt B-vaksiner og ANTI-HCV-legemidler . Fedme, en høy risikofaktor FOR HCC, har tiltrukket seg betydelig oppmerksomhet . Når lipidmetabolismen forstyrres, blir balansen brutt mellom lipidsyntese og lipid dekomponering. Reduksjonen av lipoproteinsyntese og lipofagi kan resultere i lipotoksisitet som kan forårsake kronisk leverskade . Lipotoksisitet er en av de viktigste mekanismene for utvikling AV NASH TIL HCC. Følgelig blir de metabolske relaterte faktorene som TYPE II diabetes, fedme og metabolsk syndrom risikofaktorer FOR HCC. Forskere betaler mer og mer oppmerksomhet til metabolske sykdommer og HCC. Personer med abdominal fedme har høyere risiko for HCC . Visceralt fett er av stor betydning for å forutsi tilbakefall AV HCC . Lipidakkumuleringen forårsaket av unormal lipidmetabolisme kan resultere i remodeling av fettvev. I det rekonstituerte fettvev aktiveres differensieringen av adipocytene og angiogenesen vises, noe som gir et gunstig mikromiljø for utviklingen AV HCC. Ikke bare det, unormal lipidmetabolisme kan føre til uordnet sekretorisk av adipokin preget av leptinreduksjon og økt adiponektin. Leptin kan ikke bare fremme utviklingen av leverfibrose, men også fremme utviklingen AV HCC ved å aktivere JAK / STAT-vei og ERK-vei. Oppregulert leptin kan hemme apoptose i tumorvev ved å undertrykke antiapoptotisk vei mediert Av TGFß . Leptin spiller en rolle i å fremme spredning av tumorceller. Dessuten kan leptin også gi et mikromiljø for tumorvekst. Den biologiske funksjonen til adiponektin er motsatt leptin. Adiponektin kan hemme spredning av tumorceller ved å regulere AMPK signalvei og mTOR signalvei. Jiang CM fant at lav adiponektin er nært knyttet til forekomsten AV HCC . Senescent adipocytter som hemmelig flere cytokiner kan forverre kronisk betennelse forbundet med fedme. Prosessen over som kalles SASP kan fremme utviklingen AV HCC. Når SASP-prosessen undertrykkes, reduseres forekomsten av HCC betydelig . Kronisk betennelse forårsaket av levermetabolske sykdommer, leverfibrose, død av parenkymceller og mangel på overvåking av spredning av unormale leverparenkymceller er de viktigste risikofaktorene for HCC. Park EJ gjennomførte forskning på sammenhengen mellom fedme og leverkreft, som bekreftet at det er forhold mellom unormal lipidmetabolisme og utvikling AV HCC. Forfatterne fant at mannlige mus med høyt fett diett var mer sannsynlig å utvikle HCC. Dette kan være relatert til aktivering Av HSCs og hepatocytter, som kan utskille TNF og IL-6 for å aktivere STAT3. STAT3 ER en viktig tumor transkripsjonsfaktor, som kan fremme forekomsten av leverkreft . I tillegg til teorien om inflammatorisk induksjon mener noen forskere at utviklingen AV NASH TIL HCC er forårsaket AV tnf-signalet aktivert AV TNFR1. TNFR1-signalet i hepatocytter og hepatom-stamceller kan oppreguleres med IKKß for å aktivere nf-kB-signalveien som medierer celleproliferasjon. Nakagawa h fant at hemming AV tnfr1-signalet ikke bare forhindret progresjonen AV NAFLD til NASH, men reduserte også forekomsten av HCC . Ved unormal lipidmetabolisme øker PRODUKSJONEN av ROS ved oppregulering av β-oksidasjon og ω-oksidasjon. Oksidativt stress kan skade genomet og forverre mitokondriell byrde. De skadede leverceller kan også aktivere jnk-banen som er relatert til celleoverlevelse og stress. Metabolisk lidelse av lipider spiller også en viktig rolle i svulst tilbakefall . En prospektiv studie fant at overdreven ROS forårsaket av unormal lipidmetabolisme kan øke risikoen for tilbakefall etter leverkreft kirurgi .

i Tillegg til lipidmetabolismen er FOREKOMSTEN AV HCC nært knyttet til glukosemetabolismen. Weng C j og Li C et al. utført en oppfølgingsanalyse AV IGF – 1 (insulin vekstfaktor 1) og HbA1C (glykosylert hemoglobin A1C) hos diabetespasienter og fant at blodsukker og hyperinsulinemi var signifikant relatert til forekomsten AV HCC. Effektiv blodsukkerkontroll kan redusere graden av kronisk leversykdom og redusere forekomsten AV HCC . Hyperinsulinemi kan fremme utviklingen av leverfibrose ved å aktivere HSCs og fremme angiogenese. Kontinuerlig hyperinsulinemi kan fremme utviklingen av leverkreft ved å modulere IGF-signalaksen som kan fremme spredning av hepatocytter og angiogenese . Det oppregulerte insulin OG IGF kan binde seg til insulinreseptoren og fremme dannelsen av svulster under interaksjonen AV IGFR. Dette kan være relatert TIL P13K / Akt-banen og MAPK-banen. Økt blodsukker og insulin øker NIVÅET AV IGF-1 og dets biotilgjengelighet. AKTIVERT IGF – 1 kan hemme den reseptormedierte apoptoseveien i tumorceller og fremme deres proliferasjon . Hyperglykemi og insulinresistens øker ekspresjonen AV proinflammatoriske faktorer TNF – α og IL-6, som kan føre til kronisk betennelse. Hyperglykemi kan indusere akkumulering AV ROS. Overflødig ROS kan kombineres MED DNA som fører til utvikling AV HCC .

3.4. Akutt Leversvikt

Akutt leversvikt er preget av massiv levercellenekrose. Akutt leverskade er ofte ledsaget av metabolske forstyrrelser, acidose og sepsis. Disse komplikasjonene kan føre til hypoglykemi, hypokalemi, melkesyreacidose og hyperammonemi. Unormale nivåer av metabolitter kan indusere koma. Metabolisk dysfunksjon er en viktig faktor i forverringen av akutt leversvikt . Abnormitet av lipoproteinmetabolisme skyldes akutt leversvikt og øker innholdet av kolesterol på cellemembranen. Denne prosessen kan redusere deformerbarheten av celler. Dette er grunnen til at cellene er mer utsatt for skade hos personer med unormal lipidmetabolisme. Lysosomal lipase er et viktig enzym som kan hydrolysere triglyserider og kolesterol. Dette enzymet er viktig for å dekomponere lipid i fritt kolesterol og frie fettsyrer. Når dette enzymet undertrykkes, kan lipid deponere i leveren og til slutt danne seg til akutt leversvikt . Sykdommen som mangler lysosomal lipase kalles Wolman sykdom (lysosomal syre lipase mangel). Unormal glykometabolisme induserer også akutt leversvikt. Når folk er kort av lever fruktose 1-fosfat aldolase, spise fruktose kan føre til akutt leversvikt. Akutt leversvikt kan resultere I OS (oksidativt stress), noe som medfører endringer i mitokondrielle strukturelle proteiner og DNA som resulterer I ATP-uttømming og nedsatt ATP-produksjon. Overdreven akkumulering AV ROS kan indusere et skifte I jnk-proteiner i mitokondrier, som er ansvarlige for mitokondriell inaktivering, forverring AV OS og leverskade . Det er forbigående lipidakkumulering i leveren etter større hepatektomi. Derfor er akutt leversvikt etter hepatektomi ofte ledsaget av lipidmetabolismeforstyrrelser. Ekaterina Kachaylo fant at forbedring av lever lipidmetabolisme kan redusere leversvikt etter hepatektomi ved å redusere lipidakkumulering i leveren . Korrigering av metabolsk lidelse ved akutt leversvikt er nøkkelen til å forbedre pasientens prognose. Tidlig korreksjon av unormale biokjemiske indikatorer kan redusere effekten av metabolske forstyrrelser på kroppen.

4. Konklusjoner

leveren er et viktig metabolsk organ. Leveravvik påvirker metabolsk homeostase, og metabolitter kan i sin tur spille en beskyttende eller forverrende rolle i den syke leveren. I lys av det komplekse forholdet mellom lever og metabolisme er det stort potensial i behandlingen av spesifikke leversykdommer med målrettet metabolsk terapi. Denne behandlingen forventes å forsinke eller til og med kurere sykdommen og har betydelig klinisk verdi.

Forkortelser

Interessekonflikter

forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Forfatterbidrag

Hao-ran Ding og Jing-lin Wang har gitt betydelige, direkte og intellektuelle bidrag til arbeidet. Samtidig deltok Hao-zhen Ren og Xiao-lei Shi i utformingen av studien, utarbeiding og skriving av manuskriptet, og godkjenning av det for innsending. Hao-ran Ding og Jing-lin Wang bidro like mye til dette arbeidet.

Takk

forfatterne ønsker å erkjenne teknisk bistand fra de ansatte Ved Institutt For Hepatobiliær Kirurgi, Den Tilknyttede Drum Tower Hospital Of Nanjing University Medical School, Nanjing, Kina.