To-dimensionel polyacrylamidgelelektroforese (2D-side): fremskridt og perspektiver

introduktion

de sidste 25 år, og især det sidste årti, har været vidne til en øget indsats for at udvikle teknologier, der er i stand til at identificere og kvantificere et stort antal proteiner udtrykt i et cellesystem (dvs.proteomet) i håb om at detektere sygdomsbiomarkører, kortlægge proteinkredsløb eller identificere nye fosforyleringssteder, for eksempel. Proteomets kompleksitet har gjort udvikling af metoder til effektiv adskillelse og følsom detektion af proteiner til en kritisk komponent i denne indsats. Fortsatte fremskridt inden for massespektrometri (MS) teknologi har muliggjort påvisning af proteiner med meget større hastighed og følsomhed end tidligere muligt. Selv banebrydende MS er imidlertid ikke i stand til at karakterisere alle komponenterne i et komplekst proteom. Forskere tager en” opdele og erobre ” tilgang til karakterisering af proteomer, idet de forsøger at midlertidigt begrænse antallet af proteiner, som massespektrometeret bliver bedt om at analysere. Ved at sprede proteomet vil flere proteiner i sidste ende blive analyseret inden for et individuelt eksperiment.

for at adskille proteomer har forskere brugt elektroforetiske og kromatografiske teknologier, separat og i kombination, og både offline og online. Selvom disse bestræbelser kan resultere i adskillelse og identifikation af tusinder af proteiner, kan ingen enkelt metode løse alle proteinerne i et proteom på grund af deres store antal og koncentration dynamikområde. Separationer med en enkelt dimension er utilstrækkelige til effektivt at løse komplekse proteinblandinger. Denne kendsgerning blev anerkendt for over et halvt århundrede siden af Smithies og Poulik (1), der erkendte, at en kombination af to elektroforetiske processer på en gel i rette vinkler skulle give en meget større grad af opløsning, end det er muligt med enten separat. De to elektroforetiske processer er opløsning efter molekylær størrelse og fri opløsningsmobilitet på en stivelsesgel. Deres forudsigelse er fortsat bevist sand og har dannet grundlaget for udvikling af ortogonale multidimensionelle metoder til adskillelse af komplekse blandinger ikke kun ved gelelektroforese, men også ved kromatografi og kapillærelektroforese.

for korrekt at forstå de fremskridt, der er gjort i todimensional side (2d-side), skal man gå meget længere tilbage end et kvart århundrede. I 1930 introducerede Tiselius den bevægelige grænsemetode som et analytisk værktøj til at studere elektroforese af proteiner (2). Siden hans banebrydende arbejde er forskellige former for elektroforese blevet anvendt til adskillelse af komplekse blandinger af proteiner, hver med forbedret opløsning. Allerede i 1962 demonstrerede Raymond og Aurell (3) de signifikante ikke-lineære virkninger af gelkoncentration på den elektroforetiske mobilitet af proteiner ved at anvende 2-D elektroforese ved anvendelse af forskellige acrylamidgelkoncentrationer til at adskille serumproteiner. To år senere demonstrerede Raymond (4) overlegenheden af flade pladegeler sammenlignet med cylindriske rørgeler. For eksempel giver den flade plade maksimalt overfladeareal til afkøling af gelen; de resulterende mønstre er lettere at kvantificere i standardoptagelsesdensitometre; et stort antal prøver kan behandles ved hjælp af en enkelt gelplade, hvilket letter den direkte sammenligning af prøver behandlet under identiske betingelser; og vigtigst af alt tillader den flade plade anvendelse af 2-d-separationer. Disse indsigtsfulde præferencer er bevist sande og praktiseres i dag i mange bioanalytiske laboratorier.

et andet fremskridt inden for 2-D geludskillelser blev introduceret i 1972 af Vright (5), der brugte en 4,75% (2% tværbinding) polyacrylamidgelsøjle i den første dimension, som derefter blev fjernet fra glascylinderen og lagt på den øverste kant af en 2% gradientplade. Efter elektroforese blev gelpladen anbragt i en farvningsopløsning, hvilket resulterede i visualisering af 112 opløste humane serumproteiner.

disse nye tilgange løste kun et lille antal proteiner, primært de mest rigelige proteiner i en celle eller serumproteom. Indførelsen af 2d-side i 1975 af O ‘ Farrell (6) til adskillelse af cellulære proteiner under denatureringsbetingelser muliggjorde opløsningen af hundredvis af proteiner. Det anvendte princip var meget enkelt: proteiner blev løst på en gel under anvendelse af isoelektrisk fokusering (IEF), som adskiller proteiner i den første dimension i henhold til deres isoelektriske punkt efterfulgt af elektroforese i en anden dimension i nærvær af natriumdodecylsulfat (SDS), som adskiller proteiner i henhold til deres molekylmasse. O ‘ Farrells metode er virkelig grundlaget for moderne 2D-side, som hurtigt blev tilpasset og bredt accepteret af andre forskere. Anderson og Anderson (7) brugte 2D-side til analyse af humane plasmaproteiner. De var i stand til at adskille og detektere cirka 300 forskellige proteinpletter ved farvning. I modsætning til O ‘ Farrell adskilte Manabe (8) humane plasmaproteiner ved hjælp af 2D-side uden denatureringsmidler. Cirka 230 proteinpletter kunne observeres på gelen; pletterne blev imidlertid smurt og ikke godt løst.

introduktion af immobiliserede pH-gradienter

som nævnt ovenfor omfatter 2D-side IEF i den første dimension efterfulgt af SDS-side i den anden dimension. Siden introduktionen af Kolin i 1954 (9) har IEF gennemgået flere fremskridt. Den første dimension udføres i polyacrylamidgelstænger, der dannes i glas-eller plastrør og indeholder ampholytter, der danner en pH-gradient i et elektrisk felt. Disse stænger var historisk irreproducerbare, ustabile og svære at arbejde med. Indførelsen af immobiliserede pH-gradienter (IPG ‘ er) af Bjellkvist et al. (10) havde en betydelig indvirkning på anvendelsen af IEF til at adskille komplekse blandinger over et bredt pH-område. IPG ‘ erne muliggjorde dannelsen af stabile og reproducerbare pH-gradienter, der var i stand til at fokusere sure og basiske proteiner på en enkelt gel fremstillet med brede pH-gradienter. I IPG ‘ er er bæreramcolyterne bundet til acrylamidmolekyler og støbt i gelerne for at danne en fast pH-gradient. Fastgørelse af gradienten forhindrer drift i gelen og sikrer også, at de kan støbes på en effektiv og reproducerbar måde. Brug af IPG-strimler med smal rækkevidde tillod, at et større antal proteiner blev adskilt, end det havde været muligt med standard 2D-side, fordi et smallere pH-område blev spredt ud over en større fysisk afstand. Denne spredning tillod proteiner med lignende isoelektriske punktværdier (pI) at blive adskilt med højere opløsning. For at illustrere dette punkt, Hoving et al. udviklet en 2D-side metode, hvor de anvendte smalle IPG-strimler i den første dimension (11). IPG-strimlerne var typisk 1-3 pH u brede og overlappede hinanden med mindst 0,5 pH U. der blev anvendt seks IPG-strimler, der dækkede pH-området fra 3,5 til 10. Proteiner fra en B-lymfomcellelinie blev påført på hver strimmel og adskilt under anvendelse af IEF. Hver strimmel blev derefter påført en individuel SDS-side gelplade, og proteiner blev adskilt i den anden dimension baseret på deres molekylvægt. Cirka 5000 forskellige pletter blev påvist ved hjælp af de seks IPG-strimler sammenlignet med 1500 pletter detekteret ved hjælp af en enkelt IPG-strimmel med et pH-interval på 3-10 og en enkelt standard 2D-siders gelplade. Et al. (12) sammenlignet brugen af 3 IPG–strimler med pH-intervaller på 4-5, 5-6 og 5,5-6,7 mod geler, der køres med IPG-strimler med pH-gradientområder på 3-10 og 4-7. De var i stand til at detektere 2,3 og 1,6 kilo flere proteinpletter ved hjælp af tre smalle IPG-strimler end med de to bredere gradient-range IPG-strimler (henholdsvis 3-10 og 4-7).

mens den højere opløsning, der kan opnås ved hjælp af flere overlappende smalle IPG ‘ er, muliggør identifikation af flere proteiner, kræver hver smal strimmel en separat gelplade og en vis mængde af den samme prøve, der skal indlæses på hver. Dette krav betyder, at hvis prøvevolumen eller koncentration er begrænset, er et sådant forsøg muligvis ikke muligt. For begrænsede prøver bør et bredere pH-interval eller et minimumsantal IPG ‘ er overvejes.

todimensionel Differential i gelelektroforese (2D-DIGE)

målet med at adskille proteiner ved hjælp af 2D-side er dobbelt: i) identifikation af nye proteiner og II) måling af deres relative forekomst mellem sammenlignende prøver. En fordel ved 2D-side som en separationsteknik er, at den ikke kun løser et stort antal proteiner, men farvning af disse proteiner gør det muligt at kvantificere de relative mængder af proteinerne. For eksempel lægges proteiner ekstraheret fra to serumprøver (sunde og syge) hver på en separat gelplade. Efter farvning justeres proteinpletterne og scannes for at måle deres individuelle intensiteter. Mens der er gjort mange fremskridt inden for tilpasningsværktøjer, har det været udfordrende at sikre direkte spot-to-spot sammenligning mellem to separate geler. Udviklingen af 2-D differential in-gel elektroforese (DIGE) i 1997 overvandt denne begrænsning ved at tillade op til tre forskellige proteinblandinger at blive adskilt inden for en enkelt 2D-siders gel (13). I et typisk 2D-DIGE-eksperiment, proteiner ekstraheret fra tre forskellige prøver, sund, syg og intern kontrol (en samlet prøve dannet ved blanding af lige store mængder af proteinerne ekstraheret fra de sunde og syge prøver), er kovalent mærket, hver med et cyanin fluorescerende farvestof, der har en anden ophidselses-og emissionsbølgelængde. Prøverne matches med migration, så det samme protein mærket med et hvilket som helst af farvestofferne migrerer til den samme position på gelen. De cyaninfarvestoffer, der er blevet brugt, er: 1-(5-pentyl)-1′-propylindocarbacyaninhalogenid N-hydroksysuccinimidylester (Cy3); 1-(5-carbacypentyl)-1′-methylindodicar-bacyaninhalogenid N-hydroksysuccinimidylester (Cy5); og 3-(4-carbacymethyl)phenylmethyl-3′-ethyloksacarbacyaninhalogenid N-hydroksysuccinimidyl (Cy5); og 3-(4-carbacymethyl) phenylmethyl-3 ‘ – ethyloksacarbacyaninhalogenid N-hydroksysuccinimidyl ester (CY2). Lige koncentrationer af de forskelligt mærkede proteiner og kontrolprøven blandes, påføres på en enkelt gelplade og adskilles ved hjælp af 2d-side. Kontrolprøven fungerer som en intern standard, der muliggør både Inter – og intra-gel matching. Kontrolprøven skal indeholde hvert protein, der er til stede på tværs af alle prøver i et forsøg. Dette betyder, at hvert protein i eksperimentet har et unikt signal i den interne standard, som bruges til direkte kvantitative sammenligninger inden for hver gel og til at normalisere kvantitative overflodværdier for hvert protein mellem geler. Scanning af gelen ved de specifikke eksitationsbølgelængder af hvert farvestof ved hjælp af en fluorescens imager muliggør visualisering af de differentielt mærkede proteiner (Figur 1). Billederne flettes derefter sammen og analyseres ved hjælp af billeddannelsesprogrammer, hvilket gør det muligt at sammenligne forskelle mellem overflodniveauerne af proteiner. Værdien i DIGE eliminerer enhver fejl relateret til gelforskydning og sikrer nøjagtig kvantificering (14).

proteiner af interesse udskæres fra gelen, proteolytisk fordøjes og identificeres ved hjælp af MS. Da det udføres ved hjælp af en enkelt gelplade, kræver 2D-DIGE 50% færre geler, hvilket gør det mere økonomisk og forskelle i proteinekspression mellem to forskellige prøver af proteiner lettere at sammenligne og mere præcist afbildet. Derudover kræves der mindre tid til at detektere proteinpletterne, fordi mærkningsreaktionen i DIGE er hurtigere end visualisering ved hjælp af farvningsmetoder. Når der er behov for at sammenligne proteinekspressionsniveauerne for to forskellige prøver, er DIGE den valgte metode (15).

styrker og svagheder ved 2D-side

elektroforese er en etableret teknik, der har gennemgået flere fremskridt, der har forbedret opløsning, detektion, kvantificering og reproducerbarhed. 2-D SDS-PAGE og 2D-Diges tilgange til proteinprofilering er tilgængelige og økonomiske metoder, der har høj opløsningsevne og muliggør påvisning af hundreder af proteiner på en enkelt gelplade. Selvom Reproducerbarhed har været et problem med 2D-side, især når man profilerer to proteinblandinger, er det blevet forbedret betydeligt ved brug af 2D-DIGE. Opløsningen er blevet forbedret ved introduktionen af IPG ‘ er, som gør det muligt for analytikeren at skræddersy pH-gradienten til maksimal opløsning ved hjælp af ultrasoom-geler med et smalt pH-gradientområde. Med moderne 2D-side er det ikke usædvanligt at løse to proteiner, der adskiller sig i pI med 0,001 U.

selvom 2D-side er blevet begrænset af dets manglende evne til at løse proteiner, der er for basale eller for sure, for store eller for små, mindskes denne begrænsning kontinuerligt. For eksempel kan adskillelsen af basiske proteiner analyseres ved anvendelse af IPG ‘ er i pH-området 4-12. Separationsvidenskab udvikler sig altid, og det vil ikke vare længe, før de resterende problemer med gelelektroforese er tilstrækkeligt løst.

introduktionen af 2D-DIGE bidrog enormt til at løse problemer med reproducerbarhed og kvantificering. Brugen af billeddannere og computere tillader ikke kun hurtig dataudvinding, erhvervelse og analyse, men også spotdetektion, normalisering, proteinprofilering, baggrundskorrektion og rapportering og eksport af data. Som separations -, detektions-og kvantificeringsteknik er 2D-DIGE et vigtigt redskab, især for kliniske laboratorier involveret i bestemmelse af proteinekspressionsniveauer og sygdomsbiomarkøropdagelse. Når absolut biologisk variation mellem prøver er hovedmålet, som i biomarkøropdagelse, 2D-DIGE er den valgte metode.

mens der har været betydelige fremskridt inden for nongel (eller opløsningsbaserede) metoder til kobling af fraktioneringsmetoder direkte online med MS-analyse, har 2D-PAGE været en populær teknik til gennemførelse af proteomiske undersøgelser. Selvom 2D-side, som enhver fraktioneringsordning, har sine fordele og ulemper, er der ingen tvivl om, at det vil forblive en væsentlig teknik til karakterisering af proteomer i mange år fremover.