Einleitung
Am 7. November 2014 wurde die Generaldirektion Gesundheit in Portugal von einem örtlichen Krankenhauslabor über 18 Patienten mit Legionärskrankheit informiert, die alle in den letzten 24 Stunden aus Vila Franca de Xira, einer Stadt am Rande der Hauptstadt Lissabon, aufgenommen wurden. Es stellte sich schnell heraus, dass die Fallzahlen stiegen und Fälle aus ganz Portugal identifiziert wurden. Eine multidisziplinäre Taskforce untersuchte den Ausbruch, die Ergebnisse ihrer Voruntersuchung führten zur Schließung industrieller Nasskühlsysteme. Während der Ausbruchsuntersuchung haben wir einen Bericht vorgelegt, der als Schnellkommunikation veröffentlicht wurde und vorläufige Daten der epidemiologischen, mikrobiologischen und Umweltuntersuchung enthält.1 Dieser Artikel enthält die endgültigen Ergebnisse der Ausbruchsuntersuchung.
Die Legionärskrankheit, die erstmals 1976 auf der Philadelphia American Legion Conference2 beschrieben wurde, ist eine bakterielle pneumonische Infektion mit Legionellenarten. Die meisten Fälle zugeschrieben L. pneumophila sg 1.3 Krankheit entwickelt sich charakteristisch 2-10 Tage nach dem Einatmen von aerosolisierten Bakterien durch anfällige Personen. Risikofaktoren sind Rauchen, ältere Menschen und Menschen mit chronischen kardiorespiratorischen Erkrankungen.4 Wasser, entweder in natürlichen oder künstlichen Gewässern, ist das Reservoir für Legionellenarten.5
Von 2008 bis 2012 wurden in Portugal jährlich zwischen 88 und 140 Fälle gemeldet, von denen die Mehrheit sporadisch von der Gemeinschaft erworbene Fälle waren.6 Große Ausbrüche in der Gemeinschaft können in kurzer Zeit zu erheblicher Morbidität und Mortalität führen,5 Der bisher größte wurde 2001 in Murcia, Spanien, mit 449 Fällen gemeldet.7
Industrielle Kühlturmsysteme source8 werden häufig als Quelle großer Ausbrüche in der Bevölkerung identifiziert und können kontaminierte Aerosole über große Entfernungen verbreiten.9 Meteorologische Faktoren, industrielle Betriebsbedingungen und unzureichende Wartung sind Risikofaktoren für Legionellenausbrüche im Zusammenhang mit Türmen.8,10
MethodsDefinitions
Ein bestätigter Fall der Legionärskrankheit hatte eine radiologisch bestätigte Lungenentzündung mit Symptombeginn zwischen dem 12. Oktober und dem 02. Dezember 2014, die im Umkreis von 10 km von Vila Franca de Xira lebte oder arbeitete und eine Laborbestätigung der Infektion hatte. Zu den Laborkriterien für einen bestätigten Fall gehörte die Isolierung von Legionella spp. aus Atemsekreten der Nachweis von L. pneumophila sg1-Antigen im Urin, ein signifikanter Anstieg des spezifischen Antikörperspiegels gegen L. pneumophila sg 1 in gepaarten Serumproben. Wir definierten einen wahrscheinlichen Fall, der sich nur im Labornachweis von Legionella spp. Nukleinsäure in Atemsekreten oder ein einzelnes hohes Maß an spezifischem Antikörper gegen L. pneumophila sg 1.
Identifizierung von Fällen und Bewertung der Exposition
Die Fälle wurden durch Überprüfung der gesetzlichen Labor- und elektronischen klinischen Meldungen vom 1. Oktober 2014 ermittelt. Mitarbeiter der regionalen Gesundheitsbehörden befragten alle bestätigten und wahrscheinlichen Fälle anhand eines Standardfragebogens zur portugiesischen Legionärskrankheit, in dem demografische, epidemiologische und klinische Details erfasst wurden. Die Wohnadresse jedes Falles wurde in Google Earth geokodiert.
Um Todesfälle zu identifizieren, haben wir die Ausbruchsdatenbank von November 2014 bis März 2015 regelmäßig mit dem portugiesischen Echtzeitinformationssystem für Sterbeurkunden (SICO) abgeglichen.
Quellenidentifikation
Mögliche Quellen der Legionellenkontamination, einschließlich Industrien mit Nasskühlsystemen, Krankenhäusern, Einkaufszentren und öffentlichen Erholungseinrichtungen, wurden identifiziert und vorsichtshalber bis zur Umweltuntersuchung geschlossen. Betriebs- und Wartungsberichte wurden überprüft und Proben entnommen, um auf das Vorhandensein von Legionella spp. Die Ergebnisse führten zur Identifizierung potenzieller Quellen. Die Standorte potenzieller Quellen wurden mithilfe visueller Ortung in Google Earth kartiert.
Mikrobiologische, phänotypische und genotypische Charakterisierung
Der Nachweis des L. pneumophila sg 1-Antigens wurde unter Verwendung spezifischer Antigentests im Urin in Krankenhauslabors durchgeführt. Atemwegs- und Blutproben wurden im Referenzlabor verarbeitet, das National Institute of Health Dr. Ricardo Jorge. Umweltproben wurden bei Inspektionen durch die Generalinspektion für Landwirtschaft durchgeführt erhalten, Meer, Umwelt und Raumplanung in Übereinstimmung mit portugiesischen Vorschriften, und verarbeitet durch die im Referenzlabor, das Nationale Institut für Gesundheit Dr. Ricardo Jorge.
Klinische und Umweltproben wurden unter Verwendung kultureller und/oder molekularer Techniken analysiert. Klinische Proben wurden auf BCYE-basierten Medien kultiviert und Umweltproben wurden in GVPC-selektiven Medien kultiviert. Isolate wurden durch kommerzielle Latex-Agglutinations-Kits (Legionella Latex Test, Oxoid, Großbritannien und Microgen Legionella, Microgen® Bioproducts,) identifiziert. Kulturergebnisse für klinische Proben wurden durch Echtzeit-PCR überprüft, die auf die 16S- und / oder mip-Gene abzielte (L. pneumophila Real-TM, Sacace Biotechnologies, Italien; Argene Legio pneumo / Cc r-gene, bioMérieux, Frankreich). Isolate oder kulturnegative / PCR-positive Proben wurden durch sequenzbasierte Typisierung (SBT) gemäß den Leitlinien der Europäischen Arbeitsgruppe für Legionelleninfektionen (EWGLI) charakterisiert.11 Die sieben Loci wurden einer Sanger-Sequenzierung unter Verwendung der BigDye v1.1-Chemie auf einem 3130XL-Genanalysator (Applied Biosystems) unterzogen. Die gesamte Genomsequenzierung (WGS) wurde für 10 klinische und eine Umweltprobe auf einem MiSeq-Instrument (Illumina Inc., San Diego, USA) unter Verwendung von MiSeq V2-Durchflusszellen und 150bp-Paired-End-Reads (Depth of Coverage > 100-fach), um ihre Ähnlichkeit festzustellen. Illumina Reads wurden unter Verwendung der Velvet Version 1.2.10.12
Phänotypische Charakterisierung von L zusammengestellt. pneumophila sg1 verwendete das Dresdner Panel monoklonaler Antikörper (mAbs), bestehend aus sechs mAbs plus dem MAb 3 des Internationalen Panels, das aus der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten wurde. Die Analyse folgte einem etablierten Algorithmus, der von EWGLI unterstützt wurde und L. pneumophila in eine von neun Untergruppen charakterisieren kann; Knoxville, Philadelphia, Frankreich / Allentown, Benidorm, OLDA, Oxford, Heysham, Camperdown und Bellingham.13 Das Panel umfasste Antikörper gegen MAb 3/1, das aufgrund der hohen Hydrophobie dieser Stämme als Virulenzmarker angesehen wird.
Meteorologische und Luftqualitätsaspekte
Daten wurden von der Wetterstation in Vila Franca de Xira und der lokalen Luftqualitätsstation (Alverca) erhalten. Für den Zeitraum vom 18. Oktober bis 1. November 2014 wurden zweimal täglich Aufzeichnungen über Temperatur und einmal täglich Aufzeichnungen über Luftfeuchtigkeit, Luftqualität, Windgeschwindigkeit und –richtung erhoben.
Statistische Analyse
Wir führten eine Quellenproximitätsanalyse von vier potenziellen Quellen durch, um die Hypothese zu testen, dass das Krankheitsrisiko umgekehrt mit der Entfernung von der Quelle zusammenhängt. Unter Verwendung der QGIS-Software wurde ein Puffer mit einem Radius von 10 km, der weiter in konzentrische 1 km Ringe unterteilt war, auf den Türmen jedes industriellen Kühlsystems platziert. Der Puffer und die Ringe wurden dann in vier Quadranten unterteilt, Nordosten, Südosten, Südwesten und Nordwesten. Wir haben die Anzahl der Fälle mit den erwarteten Zahlen verglichen. Um die erwarteten Fälle zu berechnen, wurden alters- und geschlechtsspezifische Raten für den Ausbruch auf die Bevölkerungszahlen des Unterabschnitts aus der Volkszählung von 2011 angewendet. Die Unterabschnitte wurden nach Entfernung und Richtung ihres geografischen Schwerpunkts von jeder Quelle kategorisiert. Die erwartete Anzahl von Fällen für jeden Bandquadranten wurde als Summe der erwarteten Fälle für die Unterabschnitte berechnet, deren Schwerpunkte darin lagen. Mit Stones ‚Test (ST) testeten wir beobachtete zu erwarteten Verhältnissen für den Rückgang des Risikos mit einer Entfernung von bis zu 10 km im Nordosten, Nordwesten, Südosten und Südwesten14 mit 9999 Monte-Carlo-Simulationen und setzten den Cut-off für die statistische Signifikanz auf 0.05.15
von Egan et al.16 wurden verwendet, um den Zeitraum der aerosolisierten Freisetzung zu Beginn des Ausbruchs abzuschätzen. Die Modelle wurden anhand von Fällen wiederholt, die bis März 2015 gemeldet wurden. Die statistische Analyse wurde mit R Statistical Software durchgeführt.
ResultsOutbreak description
Bis zum 2. Dezember 2014 wurden 403 Krankheitsfälle identifiziert, davon 377 bestätigte und 26 wahrscheinliche Fälle. Vierzehn Menschen starben (Todesfall 3,5%).
Bestätigter Fall entwickelte Symptome zwischen dem 14.Oktober und 2. Dezember 2014. Die Zahl der Fälle erreichte am 6. November ihren Höhepunkt und der Ausbruch wurde am 7. November gemeldet (Abb. 1).
Bestätigte Fälle von Legionärskrankheit nach Symptombeginn, Vila Franca de Xira, Portugal, 14. Oktober–2. Dezember 2014 (n=377).
Die höchsten Angriffsraten wurden in der Gemeinde Póvoa de Santa Iria / Forte de Casa beobachtet (60 pro 10.000 Einwohner) und fielen mit zunehmender Entfernung von dieser Gemeinde (Abb. 2).
Karte mit der Angriffsrate der Legionärskrankheit nach Wohnort (Gemeinde), Vila Franca de Xira, Portugal.
Es gab 252 bestätigte Fälle bei Männern (66%). Das Durchschnittsalter betrug 59 Jahre, die Angriffsrate war bei Männern höher und nahm bei beiden Geschlechtern mit zunehmendem Alter zu (25,1 pro 10.000 Männer im Alter von 20-64 Jahren gegenüber 37,9 pro 10.000 Männer im Alter von über 65 Jahren) und Frauen (9,0 pro 10.000 Frauen im Alter von 20-64 Jahren gegenüber 26,1 Fällen pro 10.000 Frauen im Alter von über 65 Jahren).
Zweihundertacht (55%) bestätigte Fälle berichteten auch über eine erhöhte Krankheitsanfälligkeit, die am häufigsten auf Rauchen und chronische kardiovaskuläre Atemwegserkrankungen zurückzuführen ist.
Quellenidentifikation
Neunundvierzig mögliche Quellen; häuslich, öffentlich, kommerziell und industriell (5) wurden identifiziert und nach Umweltuntersuchungen auf vier potenzielle Quellen reduziert. Alle vier waren Industrien mit Nasskühlsystemen.
Drei der vier potenziellen Quellen meldeten Verdachtsfälle bei Mitarbeitern, neun Fälle wurden bestätigt.
Mikrobiologische und phänotypische Analyse und genetische Charakterisierung
Das Referenzlabor erhielt 95 Umweltproben aus 49 möglichen Quellen, von denen L. pneumophila-positive Kulturen in 8 isoliert wurden. Diese Proben stammten aus vier Branchen mit Nasskühlsystemen und einem Gewerbegebiet. Sechs der 8 positiven Kulturen waren L. pneumophila sg 2-15 (75%). L. pneumophila sg 1 wurden aus zwei Umweltproben isoliert, die aus demselben Turm eines industriellen Systems entnommen wurden, wobei die aufgezeichneten Konzentrationen am 8. November 1,42 × 106 ufc / l und am 10. November 421 ufc / l betrugen. Die sequenzbasierte Typisierung dieser beiden Umweltisolate identifizierte den neuartigen Genotyp ST1905.
Die Laborbestätigung der Fälle erfolgte durch; Urin-Antigen-Test auf L. pneumophila sg 1 (92%); serokonversion (2%); PCR (3%) und eindeutiger Titer auf L. pneumophila (3%). 152 klinische Proben wurden an das Referenzlabor geschickt. Von diesen zeigten 71 das Vorhandensein von L. pneumophila sg 1 mit identischem ST1905 SBT-Profil.
37 Isolate von L. pneumophila sg 1 wurden phänotypisch charakterisiert, 35 Isolate aus klinischen Proben und zwei aus Umweltproben. Alle 37 Isolate zeigten die gleiche phänotypische Charakteristik; Subtyp France / Allentown und besaßen das Virulenz-assoziierte Epitop, das vom monoklonalen Antikörper MAb 3/1 erkannt wurde (Abb. 3).
Mikrobiolologische Aufbereitung und Ergebnisse klinischer Proben.
Um die genetische Verwandtschaft von ST1905-Isolaten zu bestätigen, wurden 10 der 71 klinischen Isolate und ein umweltpositives Isolat aus dem industriellen Kühlturm nominell für die Sequenzierung des gesamten Genoms ausgewählt. Wir konnten ungefähr 99 verwenden.8% jeder Entwurfssequenz und fanden keine Nukleotidunterschiede innerhalb der verglichenen 3,47 Mb des Genoms. Die phylogenetische Analyse mehrerer L. pneumophila-Isolate aus der ganzen Welt ergab, dass der ST1905-Cluster deutlich von dem Zweig abweicht, der die am meisten untersuchten L. pneumophila-Stämme (Serogruppen 1, 6 und 12) 17-19 einschreibt, und enger mit L. pneumophila subsp. fraseri-Stämme (Serogruppe 4, 5 und 15).20 WGS Die Bestätigung des ST1905-Allelprofils zeigte eine Verzerrung im Zusammenhang mit der In-Silico-Extraktion der Allelsequenz für den mompS-Locus. Der untersuchte Stamm zeigte nicht übereinstimmende mompS-Kopien, was eine korrekte ST-Zuordnung behinderte, wenn SBT ausschließlich in silico bestimmt wurde (Abb. 4).
Phylogenetischer Baum, der die gesamte Genomsequenz von Umwelt- und klinischen Isolaten vergleicht.
Meteorologische, Klima- und Luftqualitätsergebnisse
Temperaturen, die über dem Monatsdurchschnitt lagen, wurden vom 18. Oktober bis 1. November (> 20 ° C) aufgezeichnet, wobei eine anhaltende nächtliche thermische Inversion mit einem vorherrschenden NE– und NNE-Wind mit einer Geschwindigkeit von 2-3 km / h verbunden war. Die letzte Oktoberwoche hatte mehr als 80% relative Luftfeuchtigkeit mit Perioden von mehr als 90%. Der Oktober 2014 war der wärmste Oktober auf dem portugiesischen Festland seit 1931, einschließlich einer 11-tägigen Hitzewelle während der Oktoberperiode 17-27. Vom 19. Oktober bis 1. November wurde in der örtlichen Luftqualitätsstation das Dreifache des empfohlenen Feinstaubgehalts (PM10) und die höchsten wöchentlichen Werte im Jahr 2014 aufgezeichnet, was auf eine starke Episode von Sahara-Staub zurückzuführen ist, der auf das portugiesische Festland transportiert wurde.
Zeitraum der Expositionsbewertung
Die am besten geeigneten Rückberechnungsmodelle deuteten auf ein logistisches Wachstum der Umweltexposition mit der größten Intensität zwischen dem 16. Oktober und dem 4. November hin (Abb. 1).
Ergebnisse der Quellenproximity-Analyse
Als die Quellenproximity-Analyse durchgeführt wurde, gab es 365 bestätigte Fälle, von denen 328 (90%) innerhalb von 10 km von einer der vier potenziellen Quellen georeferenziert waren (Abb. 5).
Legionärskrankheit in der Nähe von vier Industrien mit Nasskühlsystemen nach Entfernung des Wohnsitzes von den Türmen.
Alle vier potenziellen Quellen zeigten einen signifikanten Rückgang des Krankheitsrisikos mit zunehmender Entfernung (Clustering) im SW-Quadranten. Das höchste Clustering (ST157, p
0,001) wurde im SW-Quadranten der Industrie 1 beobachtet. Clusterbildung wurde auch bei Industrie 2 (ST 117, p0.001), Industrie 3 (ST 126, p0.001) und Industrie 4 (ST 66.1, p0.001) beobachtet. Das Krankheitsrisiko fiel mit zunehmender Entfernung von der Quelle konsistent ab, ohne dass in diesem Quadranten Spitzen oder Täler auftraten. In den SE-Quadranten einer Branche, einem Gebiet, das größtenteils aus dem Fluss bestand, wurde kein Clustering beobachtet. Industrie 1 und 2 zeigten einen geringeren Clustergrad im NE-Quadranten (ST 5, p = 0,01 bzw. ST 4,2, p = 0,01). Clustering wurde auch im NW-Quadranten der Industrie 1 nachgewiesen (ST 3,9, p=0,01).Diskussion
Wir identifizierten vier Branchen mit Nasskühlsystem als die wahrscheinlichsten Quellen für den zweitgrößten Ausbruch der Legionärskrankheit mit 403 Fällen und 14 Todesfällen. Erhöhte Konzentrationen von L. pneumophila sg 1 ST1905 und die virulente MAb 3-1-Untergruppe wurden in den Türmen einer Industrie identifiziert. Mit SBT und WGS konnten wir die genetische Verwandtschaft der Ausbruch-assoziierten klinischen und Umweltstämme bestätigen. Die einzigen positiven Isolate für L. pneumophila sg 1 wurden beide aus dem Kühlturm einer Industrie gewonnen. Ähnliche Konzentrationen von L. pneumophila wurden in anderen Kühltürmen isoliert, die mit Ausbrüchen in Verbindung gebracht wurden.5 Es ist wahrscheinlich, obwohl unbewiesen, dass die Kreuzkontamination der vier nahe gelegenen Türme zum Ausmaß des Ausbruchs beigetragen hat und zuvor beschrieben wurde.21
Die ungewöhnlich warmen Temperaturen im Oktober 2014 unterstützten die Vermehrung von Legionellenarten in Kühlturmsystemen.22 Die hohen PM10-Konzentrationen könnten als Wolkenkonzentrationskerne gewirkt haben, die die Aerosolbildung erleichtern. Die Verteilung und die große Anzahl der Fälle sind auf den starken Wind, die hohe relative Luftfeuchtigkeit und die thermische Inversion zurückzuführen, die während des geschätzten Freisetzungszeitraums zusätzlich zur Langlebigkeit beobachtet wurden23 und erhöhte Virulenz24 eines Bakteriums mit Epitop MAb3 / 1.
Der Ausbruch ereignete sich in einem dicht besiedelten Gebiet in der Nähe der portugiesischen Hauptstadt mit stark frequentierten Pendlerrouten aus vorstädtischen Gebieten. Die tatsächliche Anzahl der exponierten Personen war wahrscheinlich viel höher als die Wohnbevölkerung. Standarddiagnosetests erkennen möglicherweise nicht alle Fälle.3 Die dargestellten Zahlen enthalten keine Fälle von Pontiac-Fieber oder Verdachtsfällen, die negativ getestet wurden, und unterschätzen daher wahrscheinlich die Morbidität der Gemeinde und die Auswirkungen auf die lokalen Gesundheitsdienste. Im Gegensatz dazu konnte aufgrund der elektronischen Todesanzeige in Portugal sichergestellt werden, dass die Informationen darüber, ob ein Fall gestorben war, vollständig waren. Die beobachteten Todesfälle (3, 5% aller Fälle) waren niedriger als die 6%, die normalerweise bei Ausbrüchen im Zusammenhang mit Kühltürmen und -systemen beobachtet wurden.8 Der ausbruchsverursachende Stamm gruppierte sich phylogenetisch abgesehen von den am meisten untersuchten ausbruchsassoziierten L. pneumophila sg 1-Stämmen (Lp Philadelphia-1, Lp Paris, Lp Lens, Lp Corby und Lp 2300/99 Alcoy). Es wurde festgestellt, dass es eng mit L. pneumophila subsp. fraseri-Stämme aus anderen Serogruppen als sg 1. Der untersuchte Stamm beherbergt eine exklusive ∼38kb genomische Region im Vergleich mit dem nächsten phylogenetisch verwandten Stamm. Diese Region erwies sich nur in einem Stamm (ATCC 33761=DSM 21215) von L als intakt und sehr ähnlich (BLASTn, Abdeckung 100%, Identität 99%, E-Wert 0,0). oakridgensis, eine Art, die selten Legionärskrankheit verursacht.25 Wir würden die geringe Fallsterblichkeit erklären, die in Bezug auf eine frühzeitige Diagnose und eine angemessene und rechtzeitige Behandlung beobachtet wurde, ob die einzigartigen Merkmale des mit dem Ausbruch verbundenen Stammes wichtigen Merkmalen der Letalität zugrunde liegen, bleibt untersucht.
Die Quellenproximitätsanalyse schätzte die erwarteten Fallzahlen der Wohnbevölkerung, was wahrscheinlich zu einer Unterschätzung der Exposition führte. Wir argumentierten, dass Wohninformationen systematisch gesammelt wurden, im Gegensatz zur Verdrängungsgeschichte, Auch die Bedingungen für die horizontale Ausbreitung von Aerosolen waren nachts ausgeprägter, wenn die meisten Bewohner in ihren Häusern gewesen wären. Ein robusterer Ansatz müsste die Analyse als Teil einer Fallkontrollstudie durchführen, die auch Expositionen bei Gebietsfremden umfassen könnte. Obwohl ursprünglich diskutiert, haben wir aufgrund von Ressourcen– und Zeitbeschränkungen keine Fall-Kontroll-Studie durchgeführt. Die enge geografische Nähe der Türme bedeutete, dass sich einige der Untersuchungsgebiete überschnitten, was es möglich machte, aber unwahrscheinlich, dass eine nahe gelegene Quelle zu einer Distanzabfallbeziehung für eine andere Quelle führen könnte. Der Vergleich der räumlichen Verteilung von Fällen mit der Modellierung von Aerosolwolken könnte von Wert sein, um die Auswirkungen eng benachbarter Quellen aufeinander zu bewerten.
Dieser Ausbruch war der zweitgrößte Ausbruch der Legionärskrankheit, der bisher verzeichnet wurde, und ergänzt die Beweislage hinsichtlich der Auswirkungen von klimatischen Bedingungen und bakteriellen Phänotypen in kühlturmbezogenen Gemeinschaftsausbrüchen der Legionärskrankheit.
Interessenkonflikte
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.