Inledning
den 7 November 2014 informerades Generaldirektoratet för hälsa i Portugal av ett lokalt sjukhuslaboratorium med 18 patienter med Legionärssjuka, alla antagna under de senaste 24 timmarna från Vila Franca de Xira, stad i utkanten av huvudstaden Lissabon. Det blev snabbt uppenbart att antalet fall ökade och fall identifierades från hela Portugal. En tvärvetenskaplig arbetsgrupp undersökte utbrottet, resultaten av deras preliminära undersökning ledde till stängning av industriella våtkylsystem. Under utbrottundersökningen presenterade vi en rapport som har publicerats som en snabb kommunikation, som ger preliminära uppgifter om den epidemiologiska, mikrobiologiska och miljöundersökningen.1 Denna artikel presenterar de slutliga resultaten av utbrottundersökningen.
Legionärssjuka, först beskriven under 1976 Philadelphia American Legion conference2 är en bakteriell pneumonisk infektion med Legionellaarter. De flesta fall som tillskrivs L. pneumophila SG 1.3-sjukdomen utvecklas karakteristiskt 2-10 dagar efter inandning av aerosoliserade bakterier av mottagliga individer. Riskfaktorer inkluderar rökning, äldre individer och de med kronisk kardiorespiratorisk sjukdom.4 vatten, antingen i naturliga eller konstgjorda vattenmiljöer, är reservoaren för Legionellaarter.5
från 2008 till 2012 rapporterades mellan 88 och 140 fall årligen i Portugal, varav majoriteten var sporadiska gemenskapsförvärvade fall.6 stora samhällsutbrott kan leda till betydande sjuklighet och dödlighet på kort tid,5 den största hittills rapporterades 2001 i Murcia, Spanien med 449 fall.7
ofta identifierade som källan till stora samhällsutbrott, industriella kyltornsystemkällor8 kan sprida förorenade aerosoler över stora avstånd.9 meteorologiska faktorer, industriella driftsförhållanden och otillräckligt underhåll är riskfaktorer för Legionella utbrott i samband med torn.8,10
Metoderdefinitioner
ett bekräftat fall av legionärssjuka hade radiologiskt bekräftad lunginflammation med symtomdebut mellan 12 oktober 02 december 2014, som bodde eller arbetade inom 10 km från Vila Franca de Xira och hade laboratoriebekräftelse av infektion. Laboratoriekriterierna för ett bekräftat fall inkluderade isolering av Legionella spp. från andningssekretioner, detektering av L. pneumophila sg1-antigen i urin, en signifikant ökning av specifik antikroppsnivå till L. pneumophila sg 1 i parade serumprover. Vi definierade ett sannolikt fall skilde sig endast i laboratoriedetektering av antingen Legionella spp. nukleinsyra i andningsutsöndringar eller en enda hög nivå av specifik antikropp mot L. pneumophila sg 1.
identifiering av fall och bedömning av exponering
fall identifierades genom att granska lagstadgade laboratorie-och elektroniska kliniska meddelanden från den 1 oktober 2014. Personal från regionala hälsovårdsmyndigheter intervjuade alla bekräftade och troliga fall som tillämpade ett vanligt portugisiskt Legionärssjukdomsformulär som registrerade demografiska, epidemiologiska och kliniska detaljer. Bostadsadressen för varje fall var geokodad i Google Earth.
för att identifiera dödsfall matchade vi regelbundet outbreak-databasen med det portugisiska realtidsinformationssystemet för dödscertifiering (SICO), från November 2014 till mars 2015.
källidentifiering
möjliga källor till Legionellakontaminering, inklusive industrier med våta kylsystem, sjukhus, gallerior och offentliga rekreationsanläggningar identifierades och stängdes som en försiktighetsåtgärd tills miljöundersökningen. Drifts-och underhållsrapporter kontrollerades och prover togs för att undersöka närvaron Legionella spp., resultat ledde till identifiering av potentiella källor. Platserna för potentiella källor kartlades med hjälp av visuell kartläggning i Google Earth.
mikrobiologisk, fenotypisk och genotypisk karakterisering
detektion av L. pneumophila sg 1-antigen utfördes med användning av specifika urinantigentester i sjukhuslaboratorier. Andnings-och blodprover behandlades vid referenslaboratoriet, National Institute of Health Dr Ricardo Jorge. Miljöprover erhölls under inspektioner utförda av General Inspectorate for Agriculture, Sea, Environment and Spatial Planning i enlighet med portugisiska bestämmelser och behandlades av vid referenslaboratoriet, National Institute of Health Dr Ricardo Jorge.
kliniska och miljöprover analyserades med användning av kultur och / eller molekylära tekniker. Kliniska prover odlades på BCYE-baserade medier och miljöprover odlades i gvpc selektiva medier. Isolat identifierades med kommersiella latex-agglutinationssatser (Legionella latex Test, Oxoid, Storbritannien och Microgen Legionella, Microgen Kazaki Bioproducts,). Odlingsresultat för kliniska prover kontrollerades med realtids-PCR riktad mot 16S-och/eller mip-generna (L. pneumophila Real-TM, Sacace Biotechnologies, Italien; Argene Legio pneumo / Cc r-gen, biomsacorieux, Frankrike). Isolat, eller kulturnegativa/PCR-positiva prover, kännetecknades av sekvensbaserad typning (SBT) i enlighet med vägledningen från European Working Group for Legionella Infections (EWGLI).11 de sju loci utsattes för Sanger-sekvensering genom att använda BigDye v1.1-kemi på en 3130xl genetisk analysator (Applied Biosystems). Hela genomsekvensering (WGS) utfördes för 10 kliniska och ett miljöprov på ett MiSeq-instrument (Illumina Inc., San Diego, USA) med användning av MiSeq V2-flödesceller och 150bp-Parade slutläsningar (täckningsdjup >100-faldigt) för att fastställa deras likhet. Illumina läser monterades med hjälp av sammet version 1.2.10.12
fenotypisk karakterisering av L. pneumophila sg1 använde Dresden-panelen av monoklonala antikroppar (MAbs) bestående av sex MAbs plus Mab 3 från den internationella Panelen erhållen från American type Culture Collection (ATCC). Analys följde en etablerad algoritm, godkänd av EWGLI som kan karakterisera L. pneumophila i en av nio undergrupper; Knoxville, Philadelphia, Frankrike/Allentown, Benidorm, OLDA, Oxford, Heysham, Camperdown och Bellingham.13 panelen inkluderade antikroppar mot MAb 3/1 som betraktas som en virulensmarkör på grund av hög hydrofobicitet hos dessa stammar.
meteorologiska och luftkvalitetsaspekter
Data erhölls från väderstationen i Vila Franca de Xira och den lokala luftkvalitetsstationen (Alverca). Inspelningar av temperatur och luftfuktighet, luftkvalitet, vindhastighet och riktning samlades in två gånger dagligen för perioden 18 oktober–1 November 2014.
statistisk analys
vi genomförde en källnärhetsanalys av fyra potentiella källor för att testa hypotesen att risken för sjukdom var omvänt relaterad till avstånd från källan. Med hjälp av QGIS-programvara placerades en buffert på 10 km radie ytterligare uppdelad i koncentriska 1 km ringar på tornen i varje industriellt kylsystem. Bufferten och ringarna delades sedan in i fyra kvadranter, nordöstra, sydöstra, sydvästra och nordvästra. Vi jämförde antalet fall med förväntat antal. För att beräkna förväntade fall tillämpades ålder och könsspecifika priser för utbrottet på underavsnittet befolkningsantal från folkräkningen 2011. Underavsnitt kategoriserades efter Avståndet och riktningen för deras geografiska centroid från varje källa. Det förväntade antalet fall för varje bandkvadrant beräknades som summan av de förväntade Fallen för de underavsnitt vars centroider låg inom den. Med hjälp av Stones Test (ST) testade vi observerade till förväntade förhållanden för riskminskning, med avstånd upp till 10 km i nordöstra, nordvästra, sydöstra och sydvästra 14 med 9999 Monte Carlo-simuleringar och satte cut-off för statistisk signifikans vid 0.05.15
tillbaka beräkningsmodeller utvecklade av Egan et al.16 användes för att uppskatta perioden för aerosoliserad frisättning i början av utbrottet. Modellerna upprepades med fall som anmälts fram till mars 2015. Statistisk analys utfördes med användning av r statistisk programvara.
ResultsOutbreak beskrivning
senast den 2 December 2014 identifierades 403 sjukdomsfall varav 377 bekräftade och 26 sannolika fall. Fjorton personer dog (dödsfall 3,5%).
bekräftat fall utvecklade symtom mellan 14 oktober och 2 December 2014. Antalet fall toppade den 6 November och utbrottet förklarades den 7 November (Fig. 1).
bekräftade fall av legionärssjuka efter datum för symtomdebut, Vila Franca de Xira, Portugal, 14 oktober–2 December 2014 (n=377).
de högsta attackhastigheterna sågs i socknen p Kambodjvoa de Santa Iria/Forte De Casa (60 per 10 000 invånare) och sjönk med ökande avstånd från denna församling (Fig. 2).
karta som visar attackfrekvensen för Legionärssjuka efter bostadsort (socken), Vila Franca de Xira, Portugal.
det fanns 252 bekräftade fall hos män (66%). Medianåldern var 59 år, attackfrekvensen var högre hos män och ökade med åldern hos båda könen (25,1 per 10 000 män i åldern 20-64 år mot 37,9 per 10 000 män över 65 år) och kvinnor (9,0 per 10 000 kvinnor i åldern 20-64 år mot 26,1 fall per 10 000 kvinnor över 65 år).
tvåhundra och åtta (55%) bekräftade fall rapporterade också ökad sjukdomskänslighet oftast på grund av rökning och kronisk hjärt-respiratorisk sjukdom.
källidentifiering
fyrtionio möjliga källor; inhemska, offentliga, kommersiella och industriella (5) identifierades och reducerades till fyra potentiella källor efter miljöundersökning. Alla fyra var industrier med våta kylsystem.
tre av de fyra potentiella källorna rapporterade misstänkta fall bland anställda, nio fall bekräftades.
mikrobiologisk och fenotypisk analys och genetisk karakterisering
referenslaboratoriet mottog 95 miljöprover från 49 möjliga källor, varav L. pneumophila positiva kulturer isolerades i 8. Dessa prover härstammar från fyra industrier med våta kylsystem och en Kommersiell lokal. Sex av de 8 positiva kulturerna var L. pneumophila sg 2-15 (75%). L. pneumophila sg 1 isolerades från två miljöprover som tagits från samma torn i ett industrisystem, registrerade koncentrationer var 1,42 106ufc/l på 8 November och 421ufc/L på 10 November. Sekvensbaserad typning av dessa två miljöisolat identifierade den nya genotypen ST1905.
laboratoriebekräftelse av fall gjordes av; urinantigentestning För L. pneumophila sg 1 (92%); serokonversion (2%); PCR (3%) och unik titer till L. pneumophila (3%). 152 kliniska prover skickades till referenslaboratoriet. Av dessa avslöjade 71 närvaron av L. pneumophila sg 1 med identisk ST1905 SBT-profil.
37 isolat av L. pneumophila sg 1 genomgick fenotypisk karakterisering, 35 isolat från kliniska prover och två från miljöprover. Alla 37 isolat presenterade samma fenotypiska egenskap; subtyp Frankrike / Allentown och hade virulensassocierad epitop igenkänd av monoklonal antikropp MAb 3/1 (Fig. 3).
mikrobiologisk bearbetning och resultat av kliniska prover.
för att bekräfta den genetiska släktskapen hos st1905-isolat valdes 10 av de 71 kliniska isolaten och ett miljöpositivt isolat erhållet från det industriella kyltornet nominellt för helgenomsekvensering. Vi kunde använda ca 99.8% av varje utkastssekvens och fann inga nukleotidskillnader inom den jämförda 3,47 Mb av genomet. Fylogenetisk analys som involverade flera L. pneumophila-isolat från hela världen avslöjade att st1905-klustret tydligt divergerade från grenen som registrerade de mest studerade L. pneumophila-stammarna (serogrupperna 1, 6 och 12)17-19 och var närmare besläktad med L. pneumophila subsp. fraseri-stammar (serogrupp 4, 5 och 15).20 WGS-bekräftelse av ST1905-allelprofilen markerade en bias associerad med in silico-extraktionen av allelsekvensen för mompS-platsen. Den studerade stammen visade icke-matchande mompS-kopior, vilket hindrade en korrekt ST-tillskrivning om SBT uteslutande bestämdes i silico (Fig. 4).
fylogenetiskt träd som jämför hela genomsekvensen av miljö-och kliniska isolat.
meteorologiska, klimat–och luftkvalitetsresultat
temperaturer över månadsmedelvärdet registrerades från 18 oktober till 1 November (>20 kcal C), med en ihållande nattlig termisk inversion associerad med en dominerande ne-och NNE-vind med 2-3 km/h Hastighet. Den sista veckan i oktober hade mer än 80% relativ luftfuktighet, med perioder över 90%. Oktober 2014 var den varmaste oktober på Portugals fastland sedan 1931, inklusive en 11 dagars värmebölja under perioden 17-27 oktober. Från 19 oktober till 1 November registrerades tre gånger den rekommenderade nivån av partiklar (PM10) och de högsta veckovärdena 2014 i den lokala luftkvalitetsstationen, tillskrivet en stark episod av Sahara-damm som transporterades till fastlandet Portugal.
exponeringsperiod
de bäst anpassade backberäkningsmodellerna föreslog en logistisk tillväxt av miljöexponeringen, med störst intensitet mellan 16 oktober och 4 November (Fig. 1).
källa närhetsanalys resultat
när källan närhetsanalys genomfördes, det fanns 365 bekräftade fall, varav 328 (90%) geo-refereras till inom 10 km av en av de fyra potentiella källorna (Fig. 5).
Legionärssjuka nära fyra industrier med våta kylsystem efter bostadsavstånd från tornet / tornen.
alla fyra potentiella källor visade en signifikant minskning av sjukdomsrisken med ökande avstånd (kluster) i SW-kvadranten. Den högsta klustringen (ST157, p
0,001) observerades i SW-kvadranten i industri 1. Kluster observerades också med industri 2 (ST 117, p0.001), industri 3 (ST 126, p0.001) och industri 4 (ST 66.1, p0.001). Risken för sjukdom föll konsekvent med ökande avstånd från källan utan tecken på toppar eller tråg i denna kvadrant. Ingen kluster observerades i SE kvadranter av någon industri, ett område som till stor del består av floden. Industri 1 och 2 visade en lägre grad av kluster i ne-kvadranten (ST 5, p=0,01 respektive ST 4,2, p=0,01). Kluster demonstrerades också i NW-kvadranten i industri 1 (ST 3.9, p=0.01).Diskussion
vi identifierade fyra branscher med våtkylsystem som de mest troliga källorna till det näst största utbrottet av legionärssjuka som registrerats med 403 fall och 14 dödsfall. Förhöjda koncentrationer av L. pneumophila sg 1 ST1905 som demonstrerar den virulenta MAb 3-1-undergruppen identifierades i tornen i en bransch. Med hjälp av SBT och WGS kunde vi bekräfta den genetiska släktskapen hos de utbrott-associerade kliniska och miljömässiga stammarna. De enda positiva isolaten För L. pneumophila sg 1, erhölls båda från kyltornet i en industri. Liknande koncentrationer av L. pneumophila har isolerats i andra kyltorn associerade med utbrott.5 det är troligt, även om det inte är bevisat att korskontaminering av de fyra närliggande tornen bidrog till utbrottets omfattning och tidigare har beskrivits.21
de ovanligt varma temperaturer som registrerades under oktober 2014 stödde spridningen av Legionellaarter i kyltornssystem.22 de höga PM10-koncentrationerna kan ha fungerat som molnkoncentrationskärnor som underlättar aerosolbildning. Fördelningen och det stora antalet fall förklaras av Ne-vinden, hög relativ fuktighet och termisk inversion som observerats under den beräknade frisättningsperioden utöver longevity23 och ökad virulens24 hos en bakterie med epitop MAb3/1.
utbrottet inträffade i ett tätbefolkat område nära huvudstaden i Portugal som innehåller kraftigt använda pendelvägar från förortsområden. Det faktiska antalet utsatta personer hade sannolikt varit mycket högre än den inhemska befolkningen. Standarddiagnostiska tester kan inte upptäcka alla fall.3. de presenterade siffrorna innehåller inte fall av Pontiac-feber eller misstänkta fall som testade negativt och underskattar därför troligen den sjuklighet som samhället upplever och påverkan på lokala hälsovårdstjänster. Däremot på grund av förekomsten av elektronisk dödsanmälan i Portugal var det möjligt att säkerställa att informationen om huruvida ett fall hade dött var fullständig. Den observerade falldödligheten (3, 5% av alla fall) var lägre än de 6% som vanligtvis observerades vid utbrott i samband med kyltorn och system.8 utbrottet orsakande stam fylogenetiskt klustrade bortsett från de mest studerade utbrott associerade L. pneumophila sg 1 stammar (lp Philadelphia-1, LP Paris, Lp Lens, lp Corby, och Lp 2300/99 Alcoy). Det visade sig vara nära besläktat med L. pneumophila subsp. fraseri-stammar från andra serogrupper än sg 1. Den studerade stammen har en exklusiv genomregion på 38kb i enlighet med den näst mest fylogenetiskt relaterade stammen. Denna region befanns vara intakt och mycket lik (BLASTn, täcka 100%, identitet 99%, E-värde 0,0) endast i en stam (ATCC 33761=DSM 21215) av L. oakridgensis, en art som sällan orsakar Legionärssjuka.25 vi skulle förklara den låga dödsfallet som observerats när det gäller tidig diagnos och lämplig och snabb behandling, om de unika egenskaperna hos den utbrottsassocierade stammen ligger till grund för viktiga egenskaper hos dödlighet förblir under studie.
källnärhetsanalysen uppskattade förväntat antal fall från den inhemska befolkningen, vilket sannolikt ledde till en underskattning av exponeringen. Vi resonerade att bostadsinformation samlades systematiskt, till skillnad från förskjutningshistoria, var också förutsättningarna för horisontell förökning av aerosoler mer uttalade på natten när de flesta invånarna skulle ha varit i sina hem. En mer robust metod skulle behöva utföra analysen som en del av en fallkontrollstudie, som också skulle kunna omfatta exponeringar i utländska invånare. Även om vi ursprungligen diskuterades fortsatte vi inte med en fallkontrollstudie på grund av resurs–och tidsbegränsningar. Tornens nära geografiska närhet innebar att det överlappades några av studieområdena vilket gjorde det möjligt, men osannolikt att en nära belägen källa kunde leda till närvaro av ett avståndsnedgångsförhållande för en annan källa. Att jämföra den geospatiala fördelningen av fall med plymmodellering av aerosol kan vara av värde för att bedöma effekterna av närliggande källor på varandra.
detta utbrott var det näst största utbrottet av legionärssjuka som hittills registrerats och lägger till bevis för effekterna av klimatförhållanden och bakteriella fenotyper i cooling tower-associerade samhällsutbrott av legionärssjuka.
intressekonflikter
författarna har inga intressekonflikter att förklara.