Introduzione
On 7 novembre 2014, la Direzione Generale Sanità, in Portogallo, è stato informato da un ospedale locale laboratorio di 18 pazienti con la malattia del Legionario, tutti ammessi nel precedente 24h da Vila Franca de Xira, cittadina alla periferia della capitale Lisbona. È stato rapidamente evidente che il numero di casi stava aumentando e i casi sono stati identificati da tutto il Portogallo. Una task force multidisciplinare ha studiato l’epidemia, i risultati della loro indagine preliminare hanno portato alla chiusura dei sistemi industriali di raffreddamento a umido. Durante l’indagine sull’epidemia, abbiamo presentato un rapporto che è stato pubblicato come una comunicazione rapida, fornendo dati preliminari dell’indagine epidemiologica, microbiologica e ambientale.1 Questo articolo presenta i risultati definitivi dell’indagine sul focolaio.
La malattia dei legionari, descritta per la prima volta durante la conferenza della Legione Americana di Filadelfia del 19762, è un’infezione batterica polmonare con specie di legionelle. La maggior parte dei casi attribuiti alla malattia di L. pneumophila sg 1.3 si sviluppa tipicamente 2-10 giorni dopo l’inalazione di batteri aerosolizzati da parte di individui sensibili. I fattori di rischio includono il fumo, gli individui più anziani e quelli con malattia cardiorespiratoria cronica.4 L’acqua, sia in ambienti acquatici naturali che artificiali, è il serbatoio per le specie di legionelle.5
Dal 2008 al 2012, in Portogallo sono stati segnalati tra 88 e 140 casi all’anno, di cui la maggior parte erano casi sporadici acquisiti in comunità.6 Grandi epidemie nella comunità possono causare morbilità e mortalità significative in un breve lasso di tempo,5 il più grande fino ad oggi è stato segnalato nel 2001 a Murcia, in Spagna, con 449 casi.7
Spesso identificati come fonte di grandi focolai comunitari, i sistemi di torri di raffreddamento industriali source8 sono in grado di diffondere aerosol contaminati su grandi distanze.9 Fattori meteorologici, condizioni operative industriali e manutenzione inadeguata sono fattori di rischio per i focolai di legionella associati alle torri.8,10
Metodidefinizioni
Un caso confermato di malattia del legionario aveva una polmonite radiologicamente confermata con insorgenza dei sintomi tra 12 ottobre ánd 02 Dicembre 2014, che viveva o lavorava entro 10 km da Vila Franca de Xira e aveva conferma di laboratorio dell’infezione. I criteri di laboratorio per un caso confermato includevano l’isolamento di Legionella spp. dalle secrezioni respiratorie, la rilevazione di L. antigene pneumophila sg1 nelle urine, un aumento significativo del livello anticorpale specifico a L. pneumophila sg 1 in campioni di siero accoppiati. Abbiamo definito un caso probabile differiva solo nel rilevamento di laboratorio di entrambi Legionella spp. acido nucleico nelle secrezioni respiratorie o un singolo alto livello di anticorpo specifico per L. pneumophila sg 1.
Identificazione dei casi e valutazione dell’esposizione
I casi sono stati identificati rivedendo le notifiche cliniche elettroniche di laboratorio e di legge a partire dal 1o ottobre 2014. Il personale delle autorità sanitarie regionali ha intervistato tutti i casi confermati e probabili applicando un questionario standard sulla malattia dei legionari portoghesi che ha registrato dettagli demografici, epidemiologici e clinici. L’indirizzo di residenza di ogni caso è stato geocodificato in Google Earth.
Per identificare i decessi, abbiamo confrontato regolarmente il database dell’epidemia con il sistema informativo portoghese in tempo reale per la certificazione della morte (SICO), da novembre 2014 a marzo 2015.
Identificazione della fonte
Sono state identificate possibili fonti di contaminazione da Legionella, comprese industrie con sistemi di raffreddamento ad umido, ospedali, centri commerciali e strutture ricreative pubbliche e, come misura precauzionale, chiuse fino all’indagine ambientale. Sono stati controllati i rapporti operativi e di manutenzione e prelevati campioni per verificare la presenza di Legionella spp., i risultati hanno condotto all’identificazione di fonti potenziali. Le posizioni delle potenziali fonti sono state mappate utilizzando l’individuazione visiva in Google Earth.
Caratterizzazione microbiologica, fenotipica e genotipica
La rilevazione dell’antigene L. pneumophila sg 1 è stata eseguita utilizzando specifici test di antigene urinario nei laboratori ospedalieri. I campioni respiratori e di sangue sono stati elaborati presso il laboratorio di riferimento, l’Istituto Nazionale di salute Dr Ricardo Jorge. I campioni ambientali sono stati ottenuti durante le ispezioni effettuate dall’Ispettorato generale per l’agricoltura, il mare, l’ambiente e la pianificazione territoriale in conformità con i regolamenti portoghesi, ed elaborati dal presso il laboratorio di riferimento, l’Istituto Nazionale di salute Dr Ricardo Jorge.
Campioni clinici e ambientali sono stati analizzati utilizzando tecniche di coltura e/o molecolari. Campioni clinici sono stati coltivati su supporti basati su BCYE e campioni ambientali sono stati coltivati in supporti selettivi GVPC. Gli isolati sono stati identificati da kit commerciali di agglutinazione al lattice (Legionella latex Test, Oxoid, Regno Unito e Microgen Legionella, Microgen® Bioproducts,). I risultati delle colture per i campioni clinici sono stati controllati mediante PCR in tempo reale mirata ai geni 16S e/o mip (L. pneumophila Real-TM, Sacace Biotechnologies, Italia; Argene Legio pneumo/Cc r-gene, bioMérieux, Francia). Gli isolati, o campioni positivi per coltura / PCR, sono stati caratterizzati da tipizzazione basata sulla sequenza (SBT) in conformità con le linee guida del Gruppo di lavoro europeo per le infezioni da legionella (EWGLI).11 I sette loci sono stati sottoposti al sequenziamento Sanger utilizzando la chimica BigDye v1.1 su un analizzatore genetico 3130XL (Applied Biosystems). Il sequenziamento dell’intero genoma (WGS) è stato eseguito per 10 campioni clinici e un campione ambientale su uno strumento MiSeq (Illumina Inc., San Diego, USA) usando usando Miseq V2 celle di flusso e 150bp accoppiati-end legge (profondità di copertura > 100 volte) per accertare la loro somiglianza. Le letture Illumina sono state assemblate utilizzando Velvet versione 1.2.10.12
Caratterizzazione fenotipica di L. pneumophila sg1 ha utilizzato il pannello di Dresda di anticorpi monoclonali (MAbs) composto da sei MAB più il MAB 3 del pannello internazionale ottenuto dalla American Type Culture Collection (ATCC). L’analisi ha seguito un algoritmo stabilito, approvato da EWGLI che può caratterizzare L. pneumophila in uno dei nove sottogruppi; Knoxville, Philadelphia, France/Allentown, Benidorm, OLDA, Oxford, Heysham, Camperdown e Bellingham.13 Il gruppo di esperti ha incluso anticorpi contro MAb 3/1 che è considerato un marker di virulenza a causa dell’elevata idrofobicità di questi ceppi.
Aspetti meteorologici e di qualità dell’aria
I dati sono stati ottenuti dalla stazione meteorologica di Vila Franca de Xira e dalla stazione locale di qualità dell’aria (Alverca). Sono state raccolte registrazioni due volte al giorno di temperatura e una volta al giorno di umidità, qualità dell’aria, velocità e direzione del vento per il periodo 18 ottobre–1 novembre 2014.
Analisi statistica
Abbiamo condotto un’analisi di prossimità delle fonti di quattro potenziali fonti per testare l’ipotesi che il rischio di malattia fosse inversamente correlato alla distanza dalla fonte. Utilizzando il software QGIS, un buffer di raggio di 10 km ulteriormente suddiviso in anelli concentrici da 1 km è stato posizionato sulle torri di ciascun sistema di raffreddamento industriale. Il buffer e gli anelli sono stati poi divisi in quattro quadranti, Nord Est, Sud Est, Sud Ovest e Nord Ovest. Abbiamo confrontato il numero di casi con i numeri attesi. Per calcolare i casi attesi, i tassi specifici per età e sesso per l’epidemia sono stati applicati ai conteggi della popolazione della sottosezione dal censimento 2011. Le sottosezioni sono state classificate in base alla distanza e alla direzione del loro centroide geografico da ciascuna fonte. Il numero previsto di casi per ciascun quadrante di banda è stato calcolato come la somma dei casi previsti per le sottosezioni i cui centroidi si trovano al suo interno. Utilizzando Stones ‘ Test (ST), abbiamo testato osservato i rapporti previsti per il declino del rischio, con distanza fino a 10 km nel Nord Est, Nord Ovest, Sud Est e Sud West14 con 9999 simulazioni Monte Carlo e impostare il cut-off per la significatività statistica a 0.05.15
Indietro modelli di calcolo sviluppati da Egan et al.16 sono stati utilizzati per stimare il periodo di rilascio aerosolizzato all’inizio dell’epidemia. I modelli sono stati ripetuti utilizzando casi notificati fino a marzo 2015. L’analisi statistica è stata condotta utilizzando il software statistico R.
Risultatidescrizione Outbreak
Entro il 2 dicembre 2014 sono stati identificati 403 casi di malattia di cui 377 confermati e 26 casi probabili. Quattordici persone sono morte (caso mortale 3,5%).
I casi confermati hanno sviluppato sintomi tra il 14 ottobre e il 2 dicembre 2014. Il numero di casi ha raggiunto il picco il 6 novembre e il focolaio è stato dichiarato il 7 novembre (Fig. 1).
Casi confermati di malattia del legionario per data di insorgenza dei sintomi, Vila Franca de Xira, Portogallo, 14 ottobre-2 dicembre 2014 (n=377).
I più alti tassi di attacco sono stati osservati nella parrocchia di Póvoa de Santa Iria / Forte de Casa (60 per 10.000 abitanti) e sono diminuiti con l’aumentare della distanza da questa parrocchia (Fig. 2).
Mappa che mostra il tasso di attacco della malattia dei Legionari per luogo di residenza (parrocchia), Vila Franca de Xira, Portogallo.
Ci sono stati 252 casi confermati negli uomini (66%). L’età media era di 59 anni, il tasso di attacco era più alto negli uomini e aumentava con l’età in entrambi i sessi (25,1 per 10.000 uomini di età compresa tra 20 e 64 anni rispetto a 37,9 per 10.000 uomini di età superiore a 65 anni) e donne (9,0 per 10.000 donne di età compresa tra 20 e 64 anni rispetto a 26,1 casi per 10.000 donne di età superiore a 65 anni).
Duecentotto (55%) casi confermati hanno anche riportato un aumento della suscettibilità alla malattia più comunemente dovuto al fumo e alla malattia cardio respiratoria cronica.
Identificazione delle fonti
Quarantanove possibili fonti; domestiche, pubbliche, commerciali e industriali (5) sono state identificate e ridotte a quattro potenziali fonti a seguito di indagini ambientali. Tutti e quattro erano industrie con sistemi di raffreddamento a umido.
Tre delle quattro fonti potenziali hanno segnalato casi sospetti tra i dipendenti, nove casi sono stati confermati.
Analisi microbiologica e fenotipica e caratterizzazione genetica
Il laboratorio di riferimento ha ricevuto 95 campioni ambientali da 49 possibili fonti,di cui le colture positive di L. pneumophila sono state isolate in 8. Questi campioni provenivano da quattro industrie con sistemi di raffreddamento a umido e un locale commerciale. Sei delle 8 colture positive erano L. pneumophila sg 2-15 (75%). L. pneumophila sg 1 sono stati isolati da due campioni ambientali prelevati dalla stessa torre di un sistema industriale, le concentrazioni registrate sono state 1,42×106ufc / l l ‘ 8 novembre e 421ufc/l il 10 novembre. La tipizzazione basata sulla sequenza di questi due isolati ambientali ha identificato il nuovo genotipo ST1905.
La conferma di laboratorio dei casi è stata effettuata da; test dell’antigene urinario per L. pneumophila sg 1 (92%); sieroconversione (2%); PCR (3%) e titolo unico a L. pneumophila (3%). 152 campioni clinici sono stati inviati al laboratorio di riferimento. Di questi, 71 hanno rivelato la presenza di L. pneumophila sg 1 con identico profilo ST1905 SBT.
37 isolati di L. pneumophila sg 1 sono stati sottoposti a caratterizzazione fenotipica, 35 isolati da campioni clinici e due da campioni ambientali. Tutti i 37 isolati presentavano la stessa caratteristica fenotipica; sottotipo France / Allentown e possedevano l’epitopo associato alla virulenza riconosciuto dall’anticorpo monoclonale MAb 3/1 (Fig. 3).
Elaborazione microbiologica e risultati di campioni clinici.
Per confermare la relazione genetica degli isolati ST1905, 10 dei 71 isolati clinici e un isolato positivo ambientale ottenuto dalla torre di raffreddamento industriale sono stati nominalmente selezionati per il sequenziamento dell’intero genoma. Siamo stati in grado di utilizzare circa 99.8% di ogni sequenza di progetto e non ha trovato differenze nucleotidiche all’interno del confronto 3.47 Mb del genoma. L’analisi filogenetica che ha coinvolto più isolati di L. pneumophila da tutto il mondo ha rivelato che il cluster ST1905 chiaramente divergeva dal ramo che arruolava i ceppi di L. pneumophila più studiati (sierogruppi 1, 6 e 12)17-19 ed era più strettamente correlato con L. pneumophila subsp. ceppi di fraseri (sierogruppo 4, 5 e 15).20 WGS conferma del profilo allelico ST1905 evidenziato un bias associato con l’estrazione in silico della sequenza allele per il mompS locus. Il ceppo studiato ha mostrato copie mompS non corrispondenti, il che ha ostacolato un’attribuzione ST corretta se SBT è stato determinato esclusivamente in silico (Fig. 4).
Albero filogenetico che confronta l’intera sequenza genomica di isolati ambientali e clinici.
Risultati meteorologici, climatici e di qualità dell’aria
Temperature superiori alla media mensile sono state registrate dal 18 ottobre al 1 novembre (>20°C), con una persistente inversione termica notturna associata a un vento predominante di NE e NNE con velocità di 2-3 km/h. L’ultima settimana di ottobre ha avuto più dell ‘ 80% di umidità relativa, con periodi superiori al 90%. Ottobre 2014 è stato l’ottobre più caldo in Portogallo continentale dal 1931, tra cui un’ondata di calore di 11 giorni durante il periodo 17-27 ottobre. Dal 19 ottobre al 1 novembre, tre volte il livello raccomandato di particolato (PM10) e i valori settimanali più alti nel 2014, è stato registrato nella stazione locale di qualità dell’aria, attribuito a un forte episodio di polvere del Sahara trasportata in Portogallo continentale.
Periodo di valutazione dell’esposizione
I modelli di back-calculation più adatti suggerivano una crescita logistica dell’esposizione ambientale, con maggiore intensità tra il 16 ottobre e il 4 novembre (Fig. 1).
Risultati dell’analisi di prossimità sorgente
Quando è stata condotta l’analisi di prossimità sorgente, ci sono stati 365 casi confermati, di cui 328 (90%) sono stati georeferenziati entro 10 km da una delle quattro fonti potenziali (Fig. 5).
Malattia dei legionari vicino a quattro industrie con sistemi di raffreddamento a umido per distanza di residenza dalla torre(s).
Tutte e quattro le fonti potenziali hanno dimostrato un calo significativo del rischio di malattia con l’aumento della distanza (clustering) nel quadrante SW. Il clustering più alto (ST157, p
0,001) è stato osservato nel quadrante SW dell’industria 1. Il clustering è stato osservato anche con l’industria 2 (ST 117, p0.001), l’industria 3 (ST 126, p0.001) e l’industria 4 (ST 66.1, p0.001). Il rischio di malattia è diminuito costantemente con l’aumentare della distanza dalla fonte senza alcuna evidenza di picchi o depressioni in questo quadrante. Nessun raggruppamento è stato osservato nei quadranti SE di qualsiasi industria, un’area che comprendeva in gran parte il fiume. Le industrie 1 e 2 hanno dimostrato un grado inferiore di clustering nel quadrante NE (ST 5, p=0,01 e ST 4,2, p=0,01 rispettivamente). Il clustering è stato dimostrato anche nel quadrante NW dell’industria 1 (ST 3.9, p=0.01).Discussione
Abbiamo identificato quattro industrie con sistema di raffreddamento a umido come le fonti più probabili del secondo più grande focolaio di malattia dei legionari registrato con 403 casi e 14 morti. Concentrazioni elevate di L. pneumophila sg 1 ST1905 dimostrando il sottogruppo virulento MAb 3-1 sono stati identificati nelle torri di un settore. Utilizzando SBT e WGS, siamo stati in grado di confermare la relazione genetica dei ceppi clinici e ambientali associati all’epidemia. Gli unici isolati positivi per L. pneumophila sg 1, sono stati entrambi ottenuti dalla torre di raffreddamento di un settore. Concentrazioni simili di L. pneumophila sono state isolate in altre torri di raffreddamento associate a focolai.5 È probabile, anche se non dimostrato che la contaminazione incrociata delle quattro torri localizzate da vicino abbia contribuito all’entità dell’epidemia ed è stata precedentemente descritta.21
Le temperature insolitamente calde registrate nel mese di ottobre 2014 hanno sostenuto la proliferazione di specie di legionelle nei sistemi di torri di raffreddamento.22 Le alte concentrazioni di PM10 potrebbero aver agito come nuclei di concentrazione delle nubi facilitando la formazione di aerosol. La distribuzione e l’elevato numero di casi sono imputabili al vento NE, all’elevata umidità relativa e all’inversione termica osservati durante il periodo di rilascio stimato, oltre alla longevità 23 e all’accresciuta virulenza24 di un batterio con epitopo MAb3/1.
L’epidemia si è verificata in un’area densamente popolata vicino alla capitale del Portogallo contenente rotte pendolari molto utilizzate dalle aree suburbane. Il numero effettivo di persone esposte era probabilmente molto più alto della popolazione residente. I test diagnostici standard potrebbero non rilevare tutti i casi.3 Le cifre presentate non contengono casi di febbre di Pontiac o casi sospetti che sono risultati negativi e quindi probabilmente sottovaluta la morbilità sperimentata dalla comunità e l’impatto sui servizi sanitari locali. Al contrario, a causa della presenza di notifica elettronica di morte in Portogallo, è stato possibile garantire che le informazioni sul decesso di un caso fossero complete. La mortalità dei casi osservati (3,5% di tutti i casi) era inferiore al 6% di solito osservato nei focolai associati a torri e sistemi di raffreddamento.8 Il ceppo causale dell’epidemia raggruppato filogeneticamente a parte i ceppi L. pneumophila sg 1 associati all’epidemia più studiati (Lp Philadelphia-1, Lp Paris, Lp Lens, Lp Corby e Lp 2300/99 Alcoy). È stato trovato per essere strettamente correlato a L. pneumophila subsp. ceppi di fraseri provenienti da sierogruppi diversi dall’sg 1. Il ceppo studiato ospita un’esclusiva regione genomica di ∼38kb rispetto al prossimo ceppo più filogeneticamente correlato. Questa regione è risultata intatta e altamente simile (BLASTn, cover 100%, identity 99%, E-value 0.0) solo in un ceppo (ATCC 33761=DSM 21215) di L. oakridgensis, una specie che raramente causa la malattia dei legionari.25 Vorremmo spiegare il basso caso di mortalità osservato in termini di diagnosi precoce e trattamento appropriato e tempestivo, se i tratti unici del ceppo associato all’epidemia sono alla base di importanti caratteristiche di mortalità rimane allo studio.
L’analisi di prossimità della fonte ha stimato il numero atteso di casi dalla popolazione residente, che probabilmente ha portato a una sottostima dell’esposizione. Abbiamo motivato che le informazioni residenziali sono state raccolte sistematicamente, a differenza della storia dello spostamento, anche le condizioni per la propagazione orizzontale degli aerosol erano più pronunciate di notte quando la maggior parte dei residenti sarebbe stata nelle loro case. Un approccio più solido dovrebbe eseguire l’analisi come parte di uno studio di controllo dei casi, che potrebbe includere anche le esposizioni nei non residenti. Anche se inizialmente discusso, non abbiamo proceduto con uno studio caso-controllo a causa di vincoli di risorse e di tempo. La stretta vicinanza geografica delle torri ha fatto sì che non vi era sovrapposizione di alcune delle aree di studio rendendo possibile, ma improbabile che una fonte vicina potrebbe portare alla presenza di un rapporto di declino distanza per un’altra fonte. Confrontare la distribuzione geospaziale dei casi con la modellazione a pennacchio dell’aerosol potrebbe essere utile per valutare l’impatto di fonti localizzate l’una sull’altra.
Questo focolaio è stato il secondo più grande focolaio di malattia dei legionari registrato fino ad oggi e si aggiunge al corpo di prove riguardanti l’impatto delle condizioni climatiche e dei fenotipi batterici nei focolai comunitari associati alla torre di raffreddamento della malattia dei legionari.
Conflitti di interesse
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.