Johdanto
7.marraskuuta 2014 paikallinen sairaalalaboratorio ilmoitti Portugalin Terveysvirastolle 18 legioonalaistautia sairastavasta potilaasta, jotka kaikki tuotiin edellisen 24. päivän aikana Vila Franca de Xirasta, pääkaupunki Lissabonin laitamilla sijaitsevasta kaupungista. Kävi nopeasti ilmi, että tapausten määrä oli kasvussa ja tapauksia havaittiin eri puolilta Portugalia. Puhkeamista tutki monialainen työryhmä, jonka esitutkinnan tulokset johtivat teollisuuden märkäjäähdytysjärjestelmien sulkemiseen. Tautitutkinnan aikana esitimme nopeana tiedonantona julkaistun raportin, jossa on alustavia tietoja epidemiologisesta, mikrobiologisesta ja ympäristöntutkimuksesta.1 Tässä artikkelissa esitellään taudinpurkaustutkimuksen lopulliset tulokset.
Legioonalaistauti, joka kuvattiin ensimmäisen kerran vuonna 1976 Philadelphia American Legion conference2: ssa, on legionellae-lajeihin kuuluva bakteeriperäinen pneumoninen infektio. Useimmissa tapauksissa johtuu L. pneumophila SG 1.3 tauti tyypillisesti kehittyy 2-10 päivän kuluttua hengitysteitse aerosolisoitujen bakteerien herkät henkilöt. Riskitekijöitä ovat tupakointi, iäkkäät henkilöt ja kroonisesta kardiorespiratorisesta sairaudesta kärsivät.4 vesi, joko luonnollisessa tai keinotekoisessa vesiympäristössä, on legionellae-lajien säiliö.5
vuosina 2008-2012 Portugalissa raportoitiin vuosittain 88-140 tapausta, joista suurin osa oli satunnaisia yhteisön hankkimia tapauksia.6 laajaa yhteisössä esiintyvää taudinpurkausta voi aiheuttaa merkittävää sairastuvuutta ja kuolleisuutta lyhyessä ajassa.5 tähän mennessä suurin tautitapaus raportoitiin vuonna 2001 Murciassa Espanjassa,jossa tapauksia oli 449.7
usein suurten yhteisössä ilmenevien taudinpurkausten lähteenä tunnettu teollisuuden jäähdytystornijärjestelmien lähteen8 pystyy levittämään saastuneita aerosoleja pitkiä matkoja.9 meteorologiset tekijät, Teolliset toimintaolosuhteet ja riittämätön huolto ovat tornitaloihin liittyvien Legionella-epidemioiden riskitekijöitä.8,10
menetelmät
vahvistetulla Legioonalaistautitapauksella oli radiologisesti vahvistettu keuhkokuume, jonka oireet alkoivat 12. lokakuuta ja 02. joulukuuta 2014 välisenä aikana, ja hän asui tai työskenteli 10 kilometrin säteellä Vila Franca de Xirasta ja sai laboratoriovahvistuksen infektiosta. Vahvistetun tapauksen laboratoriokriteereihin kuului Legionella spp: n eristäminen. hengityseritteistä L. pneumophila SG1-antigeeni virtsassa, L. pneumophila SG 1: lle spesifisen vasta-ainetason merkittävä nousu parillisissa seeruminäytteissä. Määrittelimme todennäköisen tapauksen poikkeavan vain jommankumman Legionella spp: n laboratoriohavainnosta. hengitystieeritteissä oleva nukleiinihappo tai yksittäinen korkea spesifinen vasta-ainetaso L. pneumophila sg 1: lle.
tapausten tunnistaminen ja altistumisen arviointi
tapauksia tunnistettiin tarkastelemalla lakisääteisiä laboratorioilmoituksia ja sähköisiä kliinisiä ilmoituksia 1 päivästä lokakuuta 2014. Alueellisten terveysviranomaisten henkilöstö haastatteli kaikki vahvistetut ja todennäköiset tapaukset soveltamalla Portugalin legioonalaistautia koskevaa vakiolomaketta, johon kirjattiin Demografiset, epidemiologiset ja kliiniset tiedot. Kunkin tapauksen kotiosoite geokoodattiin Google Earthissa.
kuolemien tunnistamiseksi vertasimme tautiepidemioita koskevaa tietokantaa säännöllisesti Portugalin reaaliaikaiseen kuolemien sertifiointijärjestelmään (SICO) marraskuusta 2014 maaliskuuhun 2015.
lähteiden tunnistaminen
mahdolliset Legionella-saastumisen lähteet, mukaan lukien teollisuus, jossa on märkäjäähdytysjärjestelmiä, sairaalat, ostoskeskukset ja julkiset virkistystilat, tunnistettiin ja suljettiin varotoimena ympäristötutkimuksiin asti. Toiminta-ja huoltoraportit tarkastettiin ja näytteet otettiin Legionella spp: n esiintymisen seulomiseksi., tulokset johtivat mahdollisten lähteiden tunnistamiseen. Mahdollisten lähteiden sijainnit kartoitettiin Google Earthin visuaalisella paikannuksella.
mikrobiologinen, fenotyyppinen ja genotyyppinen karakterisointi
L. pneumophila SG 1-antigeenin osoittaminen tehtiin spesifisillä virtsan antigeenitesteillä sairaalalaboratorioissa. Hengitystie-ja verinäytteet käsiteltiin vertailulaboratoriossa, National Institute of Health Tri Ricardo Jorgessa. Ympäristönäytteet otettiin tarkastuksissa, jotka maatalouden, meri -, ympäristö-ja Aluesuunnitteluvirasto teki Portugalin säännösten mukaisesti, ja ne käsitteli vertailulaboratorio, kansallinen terveysinstituutti Tri Ricardo Jorge.
kliiniset ja ympäristönäytteet analysoitiin viljely-ja / tai molekyylitekniikoilla. Kliiniset näytteet viljeltiin BCYE-pohjaisilla elatusaineilla ja ympäristönäytteet gvpc-selektiivisillä elatusaineilla. Isolaatit tunnistettiin kaupallisista lateksiagglutinaatiopakkauksista (Legionella latex Test, Oxoid, Yhdistynyt kuningaskunta ja Microgen Legionella, Microgen® Bioproducts,). Kliinisten näytteiden viljelytulokset tarkastettiin reaaliaikaisella PCR-menetelmällä, joka kohdistettiin 16S-ja/tai mip-geeneihin (L. pneumophila Real-TM, Sacace Biotechnologies, Italia; Argene Legio pneumo / Cc R-gene, bioMérieux, Ranska). Isolaateille eli viljelynegatiivisille/PCR-positiivisille näytteille oli ominaista sekvenssipohjainen tyypitys (SBT) Euroopan Legionellainfektiotyöryhmän (Ewgli) ohjeiden mukaisesti.11 seitsemälle lokukselle tehtiin Sanger-sekvensointi käyttämällä BigDye v1.1-kemiaa 3130xl: n geneettisellä analysaattorilla (Applied Biosystems). Whole genome sequencing (WGS) tehtiin 10 kliiniselle ja yhdelle ympäristönäytteelle MiSeq-laitteella (Illumina Inc., San Diego, USA) käyttämällä MiSeq V2-virtauskennoja ja 150bp-paripäätelukertoja (peittävyyden syvyys >100-kertainen) niiden samankaltaisuuden varmistamiseksi. Illumina readit koottiin Sametin versiolla 1.2.10.12
L: n fenotyyppinen Luonnehdinta. pneumophila sg1 käytti Dresdenin monoklonaalisten vasta-aineiden paneelia (mabs), joka koostui kuudesta Mab: sta sekä kansainvälisen paneelin MAb 3: sta, joka oli saatu American Type Culture Collection (ATCC) – kokoelmasta. Analyysi seurasi vakiintunut algoritmi, hyväksymä ewgli, joka voi luonnehtia L. pneumophila osaksi yksi yhdeksästä alaryhmiä; Knoxville, Philadelphia, France / Allentown, Benidorm, OLDA, Oxford, Heysham, Camperdown ja Bellingham.13 paneeli sisälsi vasta-aineita MAb 3/1: lle, jota pidetään virulenssimarkkerina näiden kantojen korkean hydrofobisuuden vuoksi.
Sää-ja ilmanlaatunäkökohdat
tiedot saatiin Vila Franca de xiran sääasemalta ja paikalliselta ilmanlaatuasemalta (Alverca). Kaksi kertaa päivässä kerättiin tallenteita lämpötilasta ja kerran päivässä tallenteita kosteudesta, ilmanlaadusta, tuulen nopeudesta ja suunnasta 18.lokakuuta–1. marraskuuta 2014.
tilastollinen analyysi
teimme neljästä mahdollisesta lähteestä lähteen läheisyysanalyysin testataksemme hypoteesia, jonka mukaan sairastumisriski oli kääntäen yhteydessä etäisyyteen lähteestä. QGIS-ohjelmiston avulla jokaisen teollisen Jäähdytysjärjestelmän torneihin sijoitettiin puskuri, jonka säde oli 10 km jaoteltuna edelleen samankeskisiin 1 km: n renkaisiin. Puskuri ja renkaat jaettiin tämän jälkeen neljään kvadranttiin, koilliseen, kaakkoon, lounaaseen ja luoteeseen. Vertailimme tapausten määrää odotettuihin lukuihin. Odotettujen tapausten laskemiseksi vuoden 2011 väestönlaskennan alaluokan väestömääriin sovellettiin taudinpurkauksen ikä-ja sukupuolikohtaisia määriä. Alaluokat luokiteltiin niiden maantieteellisen keskipisteen etäisyyden ja suunnan mukaan kustakin lähteestä. Kunkin taajuusalueen kvadrantin odotettu tapausten määrä laskettiin odotettujen tapausten summana niiden alaluokkien osalta, joiden centroidit sijoittuvat siihen. Testasimme Stonesin testin (St) avulla odotettuja riskinlaskun suhdelukuja, joiden etäisyys Koillis -, luote -, Kaakkois-ja Lounaisalueilla14 9999 Monte Carlo-simulaatioilla ja asetimme tilastollisen merkitsevyyden raja-arvoksi 0.05.15
Egan et al: n kehittämiä Back-laskentamalleja.16: ta käytettiin arvioimaan aerosolisoidun vapautumisen aikaa epidemian alussa. Mallit toistettiin maaliskuuhun 2015 asti ilmoitetuilla tapauksilla. Tilastollinen analyysi tehtiin R-tilastoohjelmiston avulla.
Tulosjulkistuskuvaus
2. joulukuuta 2014 mennessä todettiin 403 tautitapausta, joista 377 varmistettua ja 26 todennäköistä tapausta. Neljätoista ihmistä kuoli (tapauskuolema 3,5%).
vahvistettu tapaus sai oireita 14. lokakuuta – 2. joulukuuta 2014. Tapausten määrä oli huipussaan 6. marraskuuta ja epidemia julistettiin 7. marraskuuta (Kuva. 1).
vahvistetut Legioonalaistautitapaukset oireiden alkamispäivään mennessä, Vila Franca de Xira, Portugali, 14. lokakuuta-2.joulukuuta 2014 (n=377).
korkeimmat hyökkäysprosentit nähtiin Póvoa de Santa Irian/Forte de Casa-seurakunnassa (60 per 10 000 asukasta) ja ne putosivat yhä kauemmas tästä seurakunnasta (Kuva. 2).
kartta, joka näyttää Legioonalaistaudin hyökkäysnopeuden asuinpaikan (parish) mukaan, Vila Franca de Xira, Portugali.
miehillä varmistettuja tapauksia oli 252 (66%). Mediaani-ikä oli 59 vuotta, hyökkäys oli korkeampi miehillä ja lisääntyi iän myötä molemmilla sukupuolilla (25,1 / 10 000 iältään 20-64-vuotiasta miestä ja 37,9 / 10 000 yli 65-vuotiasta miestä) ja naisilla (9,0 / 10 000 iältään 20-64-vuotiasta naista ja 26,1 tapausta 10 000: ta yli 65-vuotiasta naista kohden).
Kaksisataakahdeksan (55%) vahvistettua tapausta ilmoitti myös lisääntyneestä sairausalttiudesta, joka johtui yleisimmin tupakoinnista ja kroonisesta sydänhengitystiesairaudesta.
lähteiden tunnistaminen
neljäkymmentäyhdeksän mahdollista lähdettä; kotimaiset, julkiset, kaupalliset ja teolliset (5) yksilöitiin ja vähennettiin neljään mahdolliseen lähteeseen ympäristötutkimusten jälkeen. Kaikki neljä teollisuutta olivat märkäjäähdytysjärjestelmiä.
neljästä mahdollisesta lähteestä kolme kertoi työntekijöiden epäillyistä tapauksista, yhdeksän tapausta vahvistettiin.
mikrobiologinen ja fenotyyppinen analyysi ja geneettinen Luonnehdinta
vertailulaboratorio sai 95 ympäristönäytettä 49 mahdollisesta lähteestä, joista L. pneumophila-positiivisia viljelmiä eristettiin 8. Näytteet ovat peräisin neljältä teollisuudenalalta, joilla on märkäjäähdytysjärjestelmä ja yksi liiketila. Kuusi 8 positiivisesta viljelmästä oli L. pneumophila SG 2-15 (75%). L. pneumophila sg 1 eristettiin kahdesta samasta teollisuusjärjestelmän tornista otetusta ympäristönäytteestä, kirjatut pitoisuudet olivat 1,42×106ufc/l 8.marraskuuta ja 421ufc / l 10. marraskuuta. Näiden kahden ympäristöisolaatin sekvenssipohjainen tyypitys tunnisti uuden genotyypin ST1905.
tapausten laboratoriovahvistuksen teki: L. pneumophila SG 1: n virtsan antigeenitestaus (92%); serokonversio (2%); PCR (3%) ja yksilöllinen titteri L. pneumophilalle (3%). Vertailulaboratorioon lähetettiin 152 kliinistä näytettä. Näistä 71 paljasti L. pneumophila SG 1: n esiintymisen identtisellä ST1905 SBT-profiililla.
L. pneumophila SG 1: n isolaatille tehtiin fenotyyppinen karakterisointi, 35 isolaattia kliinisistä näytteistä ja kaksi ympäristönäytteistä. Kaikilla 37 isolaatilla oli sama fenotyyppinen ominaisuus; alatyyppi France / Allentown ja niillä oli virulenssiin liittyvä epitooppi, jonka tunnistaa monoklonaalisesta vasta-aineesta MAb 3/1 (Kuva. 3).
Mikrobiolologinen käsittely ja kliinisten näytteiden tulokset.
ST1905-isolaattien geneettisen sukulaisuuden varmistamiseksi 71 kliinisestä isolaatista valittiin nimellisesti 10 ja teollisuusjäähdytystornista saatu ympäristöpositiivinen isolaatti koko genomin sekvensointiin. Pystyimme käyttämään noin 99.8% jokaisesta luonnossekvenssistä ja ei löytänyt nukleotidieroja genomin 3.47 Mb: n sisällä. Fylogeneettinen analyysi, jossa oli mukana useita L. pneumophila-isolaatteja eri puolilta maailmaa, paljasti, että st1905-klusteri erosi selvästi haarasta, johon sisältyi eniten tutkittuja L. pneumophila-kantoja (seroryhmät 1, 6 ja 12)17-19 ja oli läheisempää sukua L. pneumophila subsp: lle. fraseri-kannat (seroryhmät 4, 5 ja 15).20 WGS vahvistus st1905 allelic profiili korosti bias liittyy in silico louhinta alleeli sekvenssi mompS lokuksen. Tutkitussa kannassa näkyi ei-vastaavia mompS-kopioita, mikä haittasi oikeaa ST-attribuutiota, jos SBT määritettiin yksinomaan silicossa (Kuva. 4).
fylogeneettinen puu vertaamalla ympäristö-ja kliinisten isolaattien koko genomisarjaa.
sää–, ilmasto-ja ilmanlaatutulokset
kuukauden keskiarvon ylittäviä lämpötiloja kirjattiin 18.lokakuuta-1. marraskuuta (>20°C), ja jatkuva yöllinen terminen inversio liittyi vallitsevaan NE-ja NNE-tuuleen, jonka nopeus oli 2-3km/h. Lokakuun viimeisellä viikolla suhteellinen kosteus oli yli 80 prosenttia, ja ajanjaksot ylittivät 90 prosenttia. Lokakuu 2014 oli Manner-Portugalissa lämpimin Lokakuu sitten vuoden 1931, sisältäen 11 päivän lämpöaallon 17.-27. lokakuuta. Lokakuun 19.päivän ja marraskuun 1. päivän välisenä aikana paikallisella ilmanlaatuasemalla mitattiin kolme kertaa suositusta (PM10) ja vuoden 2014 korkeimmat viikkoarvot, mikä johtui manner-Portugaliin kulkeutuneesta Saharan pölystä.
altistumisen arviointijakso
parhaiten soveltuvien takaisinlaskentamallien mukaan ympäristöaltistus kasvaa logistisesti voimakkaimmin 16. lokakuuta ja 4. marraskuuta välisenä aikana (Kuva. 1).
lähteen läheisyysanalyysin tulokset
kun lähteen läheisyysanalyysi tehtiin, varmistettuja tapauksia oli 365, joista 328 (90%) oli maantieteellisesti viitattu 10 km: n sisällä yhdestä neljästä mahdollisesta lähteestä (Kuva. 5).
Legioonalaistauti lähellä neljää teollisuudenalaa, joissa on märkäjäähdytysjärjestelmä asuinmatkan mukaan tornista (torneista).
kaikki neljä mahdollista lähdettä osoittivat, että tautiriski pieneni merkittävästi SW-kvadrantissa etäisyyden (ryhmittelyn) kasvaessa. Suurin ryhmittymä (ST157, p
0,001) havaittiin teollisuus 1: n SW-kvadrantissa. Ryhmittelyä havaittiin myös toimialalla 2 (ST 117, S0.001), toimialalla 3 (ST 126, S0.001) ja toimialalla 4 (ST 66.1, S0.001). Sairastumisriski pieneni jatkuvasti, kun etäisyys lähteestä kasvoi, eikä tässä kvadrantissa havaittu huippuja tai kaukaloita. Yhtymäkohtia ei havaittu minkään teollisuudenalan alueella, joka koostui suurelta osin joesta. Toimialalla 1 ja toimialalla 2 havaittiin vähäisempää ryhmittelyä NE-kvadrantissa (ST 5, p=0, 01 ja ST 4, 2, p=0, 01). Ryhmittelyä osoitettiin myös teollisuus 1: n NW-kvadrantissa (ST 3.9, p=0.01).Keskustelu
tunnistimme neljä teollisuutta, joilla on märkäjäähdytysjärjestelmä, toiseksi suurimman Legioonalaistaudin todennäköisimmiksi lähteiksi, 403 tapausta ja 14 kuolemantapausta. Kohonneet l-pitoisuudet. pneumophila sg 1 ST1905, joka esitteli virulentin MAb 3-1-alaryhmän, tunnistettiin yhden teollisuuden torneista. SBT: n ja WGS: n avulla pystyimme vahvistamaan epidemiaan liittyvien kliinisten ja ympäristökantojen geneettisen yhteyden. L. pneumophila SG 1: n ainoat positiiviset isolaatit saatiin yhden teollisuuden jäähdytystornista. Samanlaisia L. pneumophila-pitoisuuksia on eristetty muista tautiepidemioihin liittyvistä jäähdytystorneista.5 on todennäköistä, joskin todistamatonta, että neljän lähellä sijaitsevan tornin ristikontaminaatio vaikutti epidemian laajuuteen ja on kuvattu aiemmin.21
lokakuun 2014 aikana mitatut poikkeuksellisen lämpimät lämpötilat tukivat Legionellojen lisääntymistä jäähdytystornijärjestelmissä.22 korkeat PM10-pitoisuudet ovat saattaneet toimia pilvien pitoisuusytiminä, jotka helpottavat aerosolien muodostumista. Epitope MAb3/1-bakteerin levinneisyyden ja suuren tapausten määrän selittää arvioidun vapautumisajan aikana havaittu tuuli, korkea suhteellinen kosteus ja terminen inversio23: n ja kohonneen virulenssi24: n lisäksi.
taudinpurkaus tapahtui tiheästi asutulla alueella lähellä Portugalin pääkaupunkia, jolla oli paljon käytettyjä lähiliikenteen reittejä esikaupunkialueilta. Todellisuudessa altistuneita oli todennäköisesti paljon enemmän kuin maassa asuvaa väestöä. Standard diagnostiset testit eivät välttämättä tunnista kaikkia tapauksia.3 esitetyt luvut eivät sisällä Pontiac-kuumetapauksia tai epäiltyjä tapauksia, joiden tulos oli negatiivinen ja jotka näin ollen todennäköisesti aliarvioivat yhteisön sairastavuutta ja vaikutusta paikallisiin terveyspalveluihin. Sen sijaan koska Portugalissa oli sähköinen kuolinilmoitus, oli mahdollista varmistaa, että tiedot siitä, oliko jokin tapaus kuollut, olivat täydelliset. Havaittu tapauskuolema (3,5% kaikista tapauksista) oli pienempi kuin jäähdytystornien ja-järjestelmien yhteydessä yleensä havaittu 6%.8 taudinpurkauksen aiheuttava kanta ryhmittyi fylogeneettisesti lukuun ottamatta tutkituimpia taudinpurkaukseen liittyviä L. pneumophila sg 1-kantoja (LP Philadelphia-1, LP Paris, LP Lens, LP Corby ja Lp 2300/99 Alcoy). Sen todettiin olevan läheistä sukua L. pneumophila subsp: lle. muiden seroryhmien kuin sg 1: n fraseri-kannat. Tutkitulla kannalla on eksklusiivinen ∼38kb genomialue verrattuna seuraavaksi fylogeneettisesti samankaltaisimpaan kantaan. Tämä alue todettiin koskemattomaksi ja hyvin samanlaiseksi (BLASTn, peittävyys 100%, identiteetti 99%, E-arvo 0,0) vain yhdessä L: n kannassa (ATCC 33761=DSM 21215). oakridgensis on laji, joka aiheuttaa harvoin legioonalaistautia.25 selittäisimme havaitun vähäisen kuolleisuuden varhaisen diagnoosin ja asianmukaisen ja oikea-aikaisen hoidon kannalta, olivatko taudinpurkaukseen liittyvän kannan ainutlaatuiset piirteet kuolettavuuden tärkeiden ominaisuuksien taustalla edelleen tutkittavana.
lähteen läheisyysanalyysi arvioi kotimaisen väestön odotettavissa olevia tapauksia, mikä todennäköisesti johti altistumisen aliarviointiin. Perustelimme, että asuintiedot kerättiin järjestelmällisesti, toisin kuin siirtohistoria, myös aerosolien horisontaalisen etenemisen edellytykset olivat voimakkaampia yöaikaan, jolloin useimmat asukkaat olisivat olleet kodeissaan. Vankemman lähestymistavan olisi tehtävä analyysi osana tapauskontrollitutkimusta, johon voitaisiin sisällyttää myös ulkomailla asuvien altistukset. Vaikka alun perin keskusteltiin, emme edenneet tapauskontrollitutkimukseen resurssien ja aikarajoitusten vuoksi. Tornien läheinen maantieteellinen läheisyys merkitsi sitä, että joillakin tutkimusalueilla oli päällekkäisyyksiä, mikä mahdollisti sen, mutta epätodennäköistä, että lähellä sijaitseva lähde voisi johtaa etäisyyksien vähenemissuhteeseen toisessa lähteessä. Tapausten paikkajakauman vertaaminen aerosolin plume-mallinnukseen voisi olla hyödyllistä arvioitaessa tiiviisti sijaitsevien lähteiden vaikutusta toisiinsa.
tämä taudinpurkaus oli toiseksi suurin tähän mennessä todettu Legioonalaistaudin taudinpurkaus, ja se täydentää todistusaineistoa ilmasto-olosuhteiden ja cooling Towerissa esiintyvien bakteerien fenotyyppien vaikutuksesta Legioonalaistaudin esiintymiseen yhteisössä.
eturistiriidat
tekijöillä ei ole eturistiriitoja ilmoitettavana.