fluoreszcencia spektroszkópia
a fluoreszcencia spektroszkópiát rutinszerűen használják a konjugált rendszerek, aromás molekulák és merev, sík vegyületek szerkezeti változásainak tanulmányozására a hőmérséklet, a pH, az ionos szilárdság, az oldószer és a ligandumok változásai miatt. Egyetlen fluorofor több ezer detektálható fotont hozhat létre, amelyek ismételten gerjeszthetők és kimutathatók, így a fluoreszcencia spektroszkópia rendkívül érzékeny technika.
a fluoreszcencia egyfajta sugárzó emisszió, amely akkor fordul elő, amikor egy molekula elnyeli az energiát olyan hullámhosszon, ahol átmeneti dipólus pillanata van. Az alapállapotban a molekulához juttatott gerjesztési energia elősegíti a fotonokat gerjesztett szingulett állapotba, ahol ezután ennek a gerjesztett szingulett állapotnak a legalacsonyabb rezgési energiaszintjére bomlanak. Ez az energia tovább ellazul a molekula alapállapotába, fotonokat bocsát ki a folyamat során, amint azt az 1.ábra mutatja.
fluoreszcens molekulák is áteshetnek a nem sugárzó relaxációnak három módja van, ahol a gerjesztési energia nem alakul át fotonokká: (1) belső átalakítás, (2) külső átalakítás és (3) rendszerközi keresztezés. A belső átalakulás akkor következik be, amikor viszonylag kis energiahézag van két elektronikus állapot között, és az elektronok átmennek egy magasabb elektronikus állapotból egy alacsonyabb energiájú állapotba. Itt az energia átkerül az elektronikus állapot vibrációs módjaiba. Mivel a vibrációs folyamatok hővezéreltek, a hőmérséklet emelkedése a fluoreszcencia intenzitásának csökkenéséhez vezet. Külső átalakítás során az energia elveszik az oldott molekulákkal való ütközéses kioltás révén a fluorofor környezetében. A rendszerek közötti keresztezés akkor következik be, amikor a szingulett és a triplett gerjesztett állapotok rezgési szintje átfedésben van az energia és az elektronok átmenetében a legalacsonyabb szingulett gerjesztett állapotból az első gerjesztett hármasállapotba. Az alapállapotba való visszatéréskor kibocsátott fotonokat foszforeszkálásnak nevezzük (1.ábra). A hármas állapot alacsonyabb energiájú, mint a szingulett állapot, így a foszforeszcencia csúcsok hosszabb hullámhosszon találhatók, mint a fluoreszcencia. Mivel ezek az átmenetek szintén tilosak, a foszforeszcencia hosszabb élettartamot mutat (~10-4 – 102 másodperc) a fluoreszcenciához képest (~10-9 – 10-6 másodperc). A hosszabb élettartam az oxigén kioltásával, az oldószer mozgásával és az intermolekuláris ütközéssel járó termikus deaktivációhoz is vezet, így a foszforeszcencia általában nem figyelhető meg szobahőmérsékleten, ezért a mintákat folyékony nitrogén hőmérsékleten kell hűteni.
Beer törvénye és koncentrációs hatásai
míg a felszívódás 10-15 másodpercnél rövidebb idő alatt történik, a relaxációs folyamat a gerjesztett állapotból az alapállapotba sokkal lassabb. Ezért a fluoreszcencia információt nyújthat a fluoroforok kölcsönhatásairól a környező molekulákkal és oldószerekkel, ellentétben az abszorpcióval.
a fluoreszcencia intenzitása egyenesen arányos a gerjesztő fény intenzitásával
F=2,303 * K * I0 * ebc
ahol K a műszer geometriáján alapuló állandó, I0 a gerjesztő fény intenzitása, e a fluorofor moláris abszorpciója, b az úthossz, c pedig a koncentráció. Mivel a fluoreszcencia intenzitása nem arányosul a beeső fény intenzitásához, mint az abszorpciós méréseknél, a fluoreszcencia érzékenysége sokkal nagyobb, mert nem korlátozza a műszerek azon képessége, hogy megkülönböztessék a beeső és a detektált intenzitást. Következésképpen kisebb koncentrációkra van szükség a mérésekhez.
a fenti egyenlet csak akkor lineáris, ha a minta abszorbanciája kisebb, mint 0,05 AU. Ha egy minta túl koncentrált, az emissziós fényt a fluorofor újra felszívhatja, enyhítve a fluoreszcencia jelet rövidebb hullámhosszon. Előfordulhat, hogy a gerjesztőfény nem hatol be teljesen egy erősen koncentrált minta Teljes szélességébe, ami szintén csökkent fluoreszcencia intenzitáshoz vezet.
fluoreszcens spektroszkópia műszer
a fluoreszcens spektrum jellemzői
a Fluorométerek gerjesztési és emissziós monokromátorból állnak, lehetővé téve a felhasználók számára, hogy mind gerjesztési, mind emissziós spektrumokat kapjanak. A fluorométerrel végzett mérés egyedülálló az egyes műszerek gerjesztési és emissziós monokromátoraiban. A fluoreszcencia közvetlenül kapcsolódik a fényáramhoz és a mérés hatékonyságához, ezért függ a műszer kialakításától és az olyan komponensektől, mint a fényforrás, a monokromátor optika és a fotoszorzó cső. Minden fényforrásnak különböző spektrális kimenete lesz (mind alakja, mind teljesítménye), amely a forrás élettartama alatt változik és csökken.
a gerjesztési spektrumok rögzített emissziós hullámhosszon ábrázolják az intenzitást, miközben változtatják a gerjesztési hullámhosszokat. Mivel a legtöbb emissziós spektrum független a gerjesztési hullámhossztól, a gerjesztési spektrumok gyakran a fluorofor abszorpciós spektrumának másolatai.
ezzel szemben egy emissziós spektrum rögzített gerjesztési hullámhosszon ábrázolja az intenzitást, miközben változó emissziós hullámhosszon pásztáz. Ezek az emissziós vizsgálatok információt szolgáltatnak a fluorofor molekuláris szerkezetéről és az azt körülvevő helyi környezetről. Mivel a fluoreszcencia-emisszió mindig a legalacsonyabb gerjesztett állapottól az alapállapotig történik, az emissziós spektrum alakja független a gerjesztési hullámhossztól. Több energiára van szükség ahhoz is, hogy a molekulát a talajból gerjesztett állapotba gerjesztsük, ami hosszabb hullámhosszúságú (azaz kisebb energiájú) emissziós csúcsokat eredményez, mint a megfelelő gerjesztési hullámhosszuk. Ezt a gerjesztési és emissziós hullámhossz közötti energiakülönbséget Stokes-eltolódásnak nevezzük.
ezenkívül az abszorpciós és emissziós spektrumok gyakran egymás tükörképei, mivel a gerjesztett és az alapállapotok rezgési energiaszintjei egyenlő eloszlásúak (3.ábra). A Franck-Condon elv elmagyarázza, hogy mivel az atommagok viszonylag nagyok, és az emisszióban és abszorpcióban részt vevő elektronikus átmenet ilyen gyors időintervallumokon megy végbe, nincs idő az atommagok mozgására és a vibrációs energiaszintekre, ezért nagyjából ugyanazok maradnak az elektronikus átmenet során.
spektrális sávszélesség
mivel a fluoreszcencia intenzitása arányos a bemeneti fény intenzitásával, a monokromátoron áthaladó fény mennyisége nagymértékben befolyásolja az intenzitást. A gerjesztés és az emissziós sávszélesség összegének a megfigyelt csúcs spektrális sávszélességének (SBW) kell lennie, hogy minden csúcs jól megoldódjon. Mindaddig, amíg ezt a hüvelykujjszabályt betartják, a sávszélességek kinyithatók az alacsony fluoreszcenciájú minták fényáteresztő képességének növelése érdekében. Az SBW-t a fluorofor Stokes-eltolódása is befolyásolhatja. A szűkebb Stokes műszakok korlátozhatják a használható elfogadható SBW-k tartományát.
fluoreszcencia leletek
a szórt fény leleteket okozhat, torzítva a fluoreszcencia spektrumot. A fluoreszcencia három leggyakoribb szórási típusa a Rayleigh, a 2. rend és a Raman szórás (3.ábra). A Rayleigh-szórás a szórt gerjesztő fény, ezért a gerjesztési hullámhosszon csúcsosodik ki. A 2. rendű szórás a gerjesztési hullámhossz kétszeresénél megfigyelt magasabb rendű szórás. A Raman-szórás az oldószerek miatt rugalmatlan szórás, a gerjesztési hullámhosszon rögzített energiájú csúcsok. A Raman-szórás fluoreszcencia-csúcstól való megkülönböztetéséhez a gerjesztési hullámhossz 5-10 nm-es lépésekben változtatható, és ha a kérdéses csúcs a gerjesztési hullámhosszal eltolódik, és intenzitása csökken, akkor ez a csúcs a Raman-szórásnak köszönhető. Azt is ellenőrizheti, hogy a csúcs az üres oldószer spektrumában van-e. Ha igen, van rá esély, hogy ez egy Raman-csúcs. Ha a fluoreszcencia csúcs túl közel van, vagy átfedésben van a Raman vagy a Rayleigh szórással, a sávszélesség és/vagy a gerjesztési hullámhossz beállítható úgy, hogy a szórást eltolja a fluoreszcencia csúcsról. Ezek a hatások a legszembetűnőbbek a nagyon alacsony fluorofor koncentrációk és különösen az erősen szóródó oldatok, mint a fehérjék, mikrogömb, nanorészecskék, valamint a szilárd anyagok.
dinamikatartomány
az automatikus Erősítésszabályozó funkció automatikusan beállítja a detektorból származó jel erősítését a fluoreszcencia intenzitása alapján. Ez optimalizálja a zajjelet a teljes szkennelt tartományban a spektrális vagy időfolyam-mérésekhez, így a különböző intenzitású csúcsok automatikusan beállíthatók az S / N javítása és az eredmény pontosságának biztosítása érdekében.
automatikus Érzékenységszabályozó rendszer (SCS)
az automatikus Érzékenységszabályozó rendszer(SCS) kibővíti az észlelt fluoreszcencia jel dinamikus tartományát azáltal, hogy automatikusan beállítja az érzékelő feszültségét a fluoreszcencia intenzitásának megfelelően. Ez lehetővé teszi a szub-pikomoláris-mikromoláris koncentrációk rögzített hullámhosszú vagy kvantitatív elemzését a műszer kézi megváltoztatása nélkül.
5.ábra. A fluoreszcein oldatok kalibrációs görbéje 5 * 10-13-tól 1,5·10-6 M-ig az auto-SCS funkcióval.
fluoreszcens spektroszkópia alkalmazása
anizotrópia
fluoreszcens anizotrópia akkor figyelhető meg, amikor a fluorofor a polarizációs tengelyektől függően különböző intenzitású fényt bocsát ki, és a következő egyenlet írja le
r=Ivv-GIvh/Ivv+2givh
hol van a kibocsátási intenzitás párhuzamos a fluoreszcens anizotrópia gerjesztő sík és a gerjesztési síkra merőleges emissziós intenzitás. A G-faktort g-faktornak vagy műszeres rácstényezőnek nevezik, és az emissziós monokromátor polarizációs függőségét adja.
minden fluorofórnak vannak átmeneti pillanatai, amelyek a molekuláris tengely mentén meghatározott irányok mentén fordulnak elő. Amikor polarizált fénynek vannak kitéve, a véletlenszerűen orientált fluoroforok, amelyek abszorpciós átmeneti pillanatai a beeső fény szöge körül vannak orientálva, izgatottak lesznek, és ez a gerjesztett állapot populáció részben orientált. Amint egy molekula visszatér a gerjesztett állapotból az alapállapotba, az elektrontöltés újraelosztódik, és a dipólus momentumok orientációjának változása befolyásolja a gerjesztési és emissziós polarizációt. Például, ha fluoreszcenciát bocsátanak ki, mielőtt egy molekula elfordulna, a fluoreszcencia fény erősen polarizálódik a gerjesztő fény polarizációjának iránya felé. Ha a fényt a molekula teljesen véletlenszerű irányba történő forgása után bocsátják ki, akkor a fluoreszcencia már nem polarizálódik.
a fluoreszcencia anizotrópia mérésekor a következő tényezők befolyásolják a molekuláris mozgást: (1) molekulaméret, (2) a molekula környezetének viszkozitása, és (3) a kötött molekula erőssége és szabadságfoka. Az anizotrópia mérései meghatározzák a fluorofor átlagos szögeltolódását, amely a foton abszorpciója és emissziója között következik be. A szögeltolódás a forgási diffúzió sebességétől és mértékétől függ a gerjesztett állapot élettartama alatt. Amikor egy fluorofor korlátlan, és szabadon foroghat a foton újbóli kibocsátása előtt, a diffúzió sebessége általában gyorsabb, mint az emisszió sebessége, és az anizotrópia nagyjából nulla. A forgási diffúzió megváltoztatja az átmeneti pillanat irányát, amely depolarizálja az emissziót. Minél korlátozottabb a fluorofor, annál nagyobb lesz az anizotrópia értéke, mivel a rugalmasság csökkenése csökkenti a teljes forgási sebességet.
FRET
fluoreszcens rezonancia energiaátvitel (FRET) egy mechanizmus, amely két szomszédos molekula közötti energiaátadást szabályozza. A donor, kezdetben gerjesztett állapotában, energiát továbbíthat egy akceptor molekulába nem sugárzó elektron rezonancia.
a FRET-et a spektrofluorométer figyeli, amely az akceptor vagy a gerjesztett donor fluoreszcenciáját/kioltását méri. A FRET hatékonysága a következő tényezőktől függ: a donor és az akceptor közötti távolság, a donor és az akceptor közötti spektrális átfedés, valamint a dipólusmomentumok összehangolása. A hatékonyság fordítottan arányos a donor és az akceptor közötti távolság hatodik erejével, így a technika rendkívül érzékeny a távolság kis változásaira. Ha a donor fluoreszcencia spektrum átfedési területe és az akceptor abszorpciós spektruma nagyobb, akkor a FRET hatékonysága nagyobb. A FRET hatásfok akkor is maximális, ha a két dipólusmomentum párhuzamos vagy anti-párhuzamos egymással, és nem történik energiaátadás, ha a dipólusmomentumok merőlegesek egymásra. Jellemzően, ha a donor és az akceptor közötti távolság betwen1 és 10 nm, akkor a FRET bekövetkezik.
Kvantumhozam és spektrális korrekció
a különböző molekuláris és környezeti feltételek nemcsak azt befolyásolják, hogy egy molekula fluoreszkál-e vagy sem, hanem meghatározhatják a kibocsátott fluoreszcens sugárzás intenzitását vagy kvantumhozamát is. A molekula fluoreszkálási hatékonyságát a kvantum hozama írja le, és az abszorbeált fotonok számának a minta által kibocsátott fotonok számához viszonyított aránya.
bizonyos esetekben pontos spektrális mérést kell meghatározni. Ez az ismert kalibrált anyagokra való hivatkozásokkal történik. Az alkalmazott kalibrált források abszolút spektrális kimenetét egy ismert műszeren ellenőrzik, és referenciaspektrumot biztosítanak a Vevőnek szállított egyedi műszer korrigálására. Ahhoz, hogy a spektrális korrekció hatékonyan működjön, azt minden műszerparaméternél és sávszélesség-kombinációnál el kell végezni, így az 5 nm-es spektrális sávszélességen végzett spektrális korrekció nem alkalmazható 10 nm-es SBW-vel történő mérésre. Ez vonatkozik a polarizátorok helyzetére, ha használják őket, valamint a magasabb rendű szűrők használatára. El kell végezni a spektrális korrekciót az ügyfél által használandó spektrális sávszélességek minden egyes kombinációjára, a magasabb rendű szűrő kiválasztásának beillesztésére vagy kizárására, valamint a polarizátorok helyzetére, ha vannak ilyenek. A minta gerjesztése és az emissziós hullámhossz határozza meg, hogy milyen oldatot/fényforrást használnak a kalibráláshoz.
közeli infravörös
a spektrum NIR tartományát vizsgáló alkalmazásoknál a PMT detektor spektrális válasza kritikus az adatok megszerzéséhez. A látható régió piros végén, a NIR-be, a PMT kvantumhatékonysága jelentősen csökken, ami a mintamérések során alig vagy egyáltalán nem eredményez jelintenzitást. A FRET kísérleteket és a NIR festékeket és szondákat gyakran 500 nm feletti hullámhosszon figyelik, és sok esetben kis jelekkel rendelkeznek, még olyan érzékeny technikáknál is, mint a fluoreszcencia. A 8. ábra a rodamin B fluoreszcencia intenzitásának különbségét szemlélteti egy standard PMT alkalmazásával, összehasonlítva egy olyan PMT-vel, amely érzékenyebb a spektrum vörös végén lévő hullámhosszokra.
Kiegészítő Technika:
körkörös dikroizmus spektroszkópia
a körkörös dikroizmus spektroszkópia (CD) egy alapvető analitikai technika, amelyet a molekulák kiralitásának optikai aktivitásuk révén történő elemzésére használnak. A CD sokféle molekuláris szerkezetre alkalmazható, de a tudományos közösségben kedvezőnek találta a makromolekuláris szerkezet, különösen a fehérjék és a nukleinsavak tisztázását.