Innledning
Den 7. November 2014 ble Generaldirektoratet For Helse i Portugal informert av et lokalt sykehuslaboratorium av 18 pasienter Med Legionærsykdom, alle innlagt i forrige 24 timer Fra Vila Franca De Xira, by i utkanten Av hovedstaden Lisboa. Det ble raskt klart at antall tilfeller var stigende og tilfeller ble identifisert fra Hele Portugal. En tverrfaglig arbeidsgruppe undersøkte utbruddet, resultatene av deres foreløpige undersøkelse førte til nedleggelse av industrielle våte kjølesystemer. Under utbruddsundersøkelsen presenterte vi en rapport som har blitt publisert som en rask kommunikasjon, og gir foreløpige data om den epidemiologiske, mikrobiologiske og miljømessige undersøkelsen.1 Denne artikkelen presenterer de endelige resultatene av utbruddsundersøkelsen.
Legionærsykdom, først beskrevet under 1976 Philadelphia American Legion conference2 Er en bakteriell pneumonisk infeksjon Med Legionellae arter. De fleste tilfeller tilskrives L. pneumophila Sg 1.3 Sykdom utvikler karakteristisk 2-10 dager etter innånding av aerosoliserte bakterier av mottakelige individer. Risikofaktorer inkluderer røyking, eldre personer og de med kronisk kardiorespiratorisk sykdom.4 Vann, enten i naturlige eller kunstige akvatiske miljøer, er reservoaret For Legionellae arter.5
fra 2008 til 2012 ble Mellom 88 og 140 tilfeller rapportert årlig i Portugal, hvorav flertallet var sporadiske samfunnsmessige tilfeller.6 store samfunnsutbrudd kan resultere i betydelig sykelighet og dødelighet på kort tid, 5 den største hittil ble rapportert i 2001 I Murcia, Spania med 449 tilfeller.7
ofte identifisert som kilden til store samfunnet utbrudd, industrielle kjøletårn systemer source8 er i stand til å spre forurenset aerosoler over store avstander.9 Meteorologiske faktorer, industrielle driftsforhold og utilstrekkelig vedlikehold er risikofaktorer for Legionellautbrudd knyttet til tårn.8,10
Metoderdefinisjoner
et bekreftet Tilfelle Av Legionærsykdom hadde radiologisk bekreftet pneumoni med symptomdebut mellom 12. oktober á 02. desember 2014, som bodde eller jobbet innenfor 10 km Fra Vila Franca De Xira og hadde laboratoriebekreftelse på infeksjon. Laboratoriekriteriene for et bekreftet tilfelle inkluderte isolering Av Legionella spp. fra respiratoriske sekresjoner, deteksjon Av L. pneumophila sg1 antigen i urin, en signifikant økning i spesifikt antistoffnivå Til L. pneumophila sg 1 i parede serumprøver. Vi definerte et sannsynlig tilfelle forskjellig bare i laboratoriedeteksjonen av Enten Legionella spp. nukleinsyre i respiratoriske sekresjoner eller et enkelt høyt nivå av spesifikt antistoff Mot l. pneumophila sg 1.
identifisering av saker og vurdering av eksponering
Saker ble identifisert ved gjennomgang av lovpålagte laboratorie-og elektroniske kliniske meldinger fra 1. oktober 2014. Ansatte fra regionale helsemyndigheter intervjuet alle bekreftede og sannsynlige tilfeller ved å bruke et standard portugisisk Legionærsykdoms spørreskjema som registrerte demografiske, epidemiologiske og kliniske detaljer. Bostedsadressen til hvert tilfelle ble geokodet I Google Earth.
for å identifisere dødsfall, krysset vi regelmessig utbruddsdatabasen med det portugisiske real time information system for death certification (SICO), fra November 2014 Til Mars 2015.
Kildeidentifikasjon
Mulige Kilder Til Legionellaforurensning, inkludert næringer med våte kjølesystemer, sykehus, kjøpesentre og offentlige rekreasjonsfasiliteter, ble identifisert og som et mål for forholdsregel lukket til miljøundersøkelse. Drifts-og vedlikeholdsrapporter ble sjekket og prøver tatt til skjermen for tilstedeværelse Legionella spp. resultatene førte til identifisering av potensielle kilder. Plasseringen av potensielle kilder ble kartlagt ved hjelp av visuell pinpointing I Google Earth.
Mikrobiologisk, fenotypisk og genotypisk karakterisering
Påvisning Av l. pneumophila sg 1-antigen ble utført ved bruk av spesifikke urinantigenester i sykehuslaboratorier. Åndedretts-og blodprøver ble behandlet Ved referanselaboratoriet, Nasjonalt Institutt For Helse Dr Ricardo Jorge. Miljøprøver ble innhentet under inspeksjoner utført Av General Inspectorate For Landbruk, Sjø, Miljø Og Arealplanlegging i samsvar med portugisiske forskrifter, og behandlet av ved referanselaboratoriet, National Institute Of Health Dr Ricardo Jorge.
Kliniske og miljømessige prøver ble analysert ved hjelp av kultur-og / eller molekylære teknikker. Kliniske prøver ble dyrket PÅ BCYE-baserte medier og miljøprøver ble dyrket I gvpc selektive medier. Isolater ble identifisert med kommersielle latex-agglutinasjonssett(Legionella latex Test, Oxoid, Storbritannia og Microgen Legionella, Microgen® Bioproducts,). Kulturresultater for kliniske prøver ble kontrollert av sanntids PCR rettet mot 16s-og / eller mip-genene (L. pneumophila Real-TM, Sacace Biotechnologies, Italia; Argene Legio pneumo/Cc r-gene, biomé, Frankrike). Isolater, eller kulturnegative/PCR-positive prøver, ble karakterisert ved sekvensbasert typing (sbt) i samsvar Med veiledningen Fra European Working Group For Legionella Infections (EWGLI).11 de syv loci ble utsatt For Sanger sekvensering ved Hjelp Av BigDye v1.1 kjemi PÅ EN 3130xl Genetisk Analysator (Applied Biosystems). Hele genomsekvensering (WGS)ble utført for 10 kliniske og en miljøprøve på Et MiSeq-instrument (Illumina Inc., San Diego, USA) ved Hjelp Av MiSeq V2 strømningsceller og 150bp parret-end leser (dybde på dekning > 100 ganger)for å fastslå deres likhet. Illumina leser ble samlet ved Hjelp Av Velvet versjon 1.2.10.12
Fenotypisk karakterisering Av L. pneumophila sg1 brukte Dresden-panelet av monoklonale antistoffer (MAbs) bestående av seks MAbs pluss Mab 3 fra Det Internasjonale Panelet hentet fra American Type Culture Collection (Atcc). Analyse fulgte en etablert algoritme, godkjent AV EWGLI som kan karakterisere l. pneumophila i en av ni undergrupper; Knoxville, Philadelphia, France / Allentown, Benidorm, OLDA, Oxford, Heysham, Camperdown og Bellingham.13 panelet inkluderte antistoffer Mot MAb 3/1 som anses som en virulensmarkør på grunn av høy hydrofobisitet av disse stammene.
meteorologiske og luftkvalitetsaspekter
data ble hentet Fra værstasjonen I Vila Franca De Xira og den lokale luftkvalitetsstasjonen (Alverca). To ganger daglig opptak av temperatur og en gang daglig opptak av fuktighet, luftkvalitet, vindhastighet og retning ble samlet for perioden 18. oktober–1. November 2014.
Statistisk analyse
vi gjennomførte en nærhetsanalyse av fire potensielle kilder for å teste hypotesen om at risiko for sykdom var omvendt relatert til avstand fra kilden. VED HJELP AV qgis-programvare ble en buffer på 10 km radius videre oppdelt i konsentriske 1 km ringer plassert på tårnene til hvert industrielt kjølesystem. Bufferen og ringene ble deretter delt inn i Fire kvadranter, Nordøst, Sørøst, Sørvest og Nordvest. Vi sammenlignet antall tilfeller med forventede tall. For å beregne forventede tilfeller ble alder og kjønnsspesifikke priser for utbruddet brukt på underpopulasjonstallene fra 2011-folketellingen. Delseksjoner ble kategorisert i henhold til avstanden og retningen av deres geografiske sentroid fra hver kilde. Det forventede antall tilfeller for hver båndkvadrant ble beregnet som summen av de forventede tilfellene for delseksjonene hvis sentroider lå innenfor den. Ved Hjelp Av Stones ‘ Test (ST), testet vi observert til forventede forhold for nedgang i risiko, med avstand opp til 10km I Nordøst, Nordvest, Sørøst Og Sørvest14 med 9999 Monte Carlo simuleringer og satt cut-off for statistisk signifikans på 0.05.15
Tilbake beregningsmodeller utviklet Av Egan et al.16 ble brukt til å estimere perioden for aerosolisert frigjøring ved starten av utbruddet. Modellene ble gjentatt ved hjelp av saker varslet frem Til Mars 2015. Statistisk analyse ble utført ved Hjelp av r statistisk programvare.
Resultaterutbruddsbeskrivelse
innen 2. desember 2014 ble det identifisert 403 sykdomsfall, hvorav 377 bekreftede og 26 sannsynlige tilfeller. Fjorten personer døde (dødsfall 3,5%).
Bekreftet tilfelle utviklet symptomer mellom 14. oktober og 2. desember 2014. Antall tilfeller toppet på 6 November og utbruddet ble erklært på 7 November (Fig. 1).
Bekreftede Tilfeller Av Legionærsykdom etter symptomdebut, Vila Franca De Xira, Portugal, 14. oktober–2. desember 2014 (n=377).
de høyeste angrepsratene ble sett I sognet Pó De Santa Iria / Forte De Casa (60 per 10 000 innbyggere) og falt med økende avstand fra dette sognet (Fig. 2).
Kart som viser angrepsraten For Legionærsykdom etter bosted (sogn), Vila Franca De Xira, Portugal.
det var 252 bekreftede tilfeller hos menn (66%). Median alder var 59 år, angrepsraten var høyere hos menn og økte med alder hos begge kjønn (25,1 per 10 000 menn i alderen 20-64 år mot 37,9 per 10 000 menn over 65 år) og kvinner (9,0 per 10 000 kvinner i alderen 20-64 år mot 26,1 tilfeller per 10 000 kvinner over 65 år).
To hundre og åtte (55%) bekreftede tilfeller rapporterte også økt sykdomsfølsomhet oftest på grunn av røyking og kronisk hjerte-luftveissykdom.
Kildeidentifikasjon
Førtini mulige kilder; innenlands, offentlig, kommersiell og industriell (5) ble identifisert og redusert til fire potensielle kilder etter miljøundersøkelser. Alle fire var næringer med våte kjølesystemer.
Tre av de fire potensielle kildene rapporterte mistenkte tilfeller blant ansatte, ni saker ble bekreftet.
Mikrobiologisk og fenotypisk analyse og genetisk karakterisering
referanselaboratoriet mottok 95 miljøprøver fra 49 mulige kilder, hvorav l. pneumophila positive kulturer ble isolert i 8. Disse prøvene stammer fra fire næringer med våte kjølesystemer og ett næringsbygg. Seks av de 8 positive kulturer var L. pneumophila sg 2-15 (75%). L. pneumophila sg 1 ble isolert fra to miljøprøver tatt fra samme tårn i ett industrisystem, registrerte konsentrasjoner var 1,42×106ufc/l 8. November og 421ufc / l 10. November. Sekvensbasert typing av disse to miljøisolatene identifiserte den nye genotypen ST1905.
Laboratoriebekreftelse av tilfeller ble gjort av; urin antigen testing For L. pneumophila sg 1 (92%); serokonversjon (2%); PCR (3%) og unik titer For L. pneumophila (3%). 152 kliniske prøver ble sendt til referanselaboratoriet. Av disse viste 71 tilstedeværelsen Av l. pneumophila sg 1 med identisk ST1905 SBT-profil.
37 isolater Av l. pneumophila sg 1 gjennomgikk fenotypisk karakterisering, 35 isolater fra kliniske prøver og to fra miljøprøver. Alle 37 isolater presenterte samme fenotypiske karakteristikk; Subtype France / Allentown og hadde virulensassosiert epitop anerkjent av monoklonalt antistoff MAb 3/1 (Fig. 3).
Mikrobiolologisk behandling og resultater av kliniske prøver.
for å bekrefte den genetiske slektskap AV st1905 isolater, 10 av de 71 kliniske isolater og en miljømessig positiv isolat oppnådd fra den industrielle kjøletårn ble nominelt valgt for hele genomsekvensering. Vi var i stand til å bruke ca 99.8% av hver utkast sekvens og fant ingen nukleotid forskjeller innenfor sammenlignet 3.47 Mb av genomet. Fylogenetisk analyse som involverer flere l. pneumophila-isolater fra hele verden viste AT st1905-klyngen tydelig divergerte fra grenen som registrerte De mest studerte l. pneumophila-stammene (serogrupper 1, 6 og 12) 17-19 og var nærmere beslektet Med L. pneumophila subsp. fraseri stammer (serogruppe 4, 5 og 15).20 wgs bekreftelse AV st1905 allelic profil uthevet en skjevhet forbundet med i silico utvinning av allel sekvens for mompS locus. Den studerte stammen viste ikke-matchende mompS-kopier, noe som hindret en riktig st-attribusjon hvis SBT utelukkende ble bestemt i silico (Fig. 4).
Fylogenetisk tre som sammenligner hele genomsekvensen av miljømessige og kliniske isolater.
Meteorologiske, klima-og luftkvalitetsresultater
Temperaturer over månedsgjennomsnittet ble registrert fra 18. oktober til 1. November (> 20°C), med en vedvarende nattlig termisk inversjon assosiert med en dominerende NE-og NNE-vind med 2-3km / t hastighet. Den siste uken i oktober hadde mer enn 80% relativ fuktighet, med perioder over 90%. Oktober 2014 var Den varmeste oktober i Fastlands-Portugal siden 1931, inkludert en 11 dagers hetebølge i perioden 17. -27. oktober. Fra 19. oktober til 1. November ble tre ganger det anbefalte nivået av partikler (PM10) og de høyeste ukentlige verdiene i 2014 registrert i den lokale luftkvalitetsstasjonen, tilskrevet en sterk episode Av Saharastøv transportert til fastlandet Portugal.
periode med eksponeringsvurdering
de best passende bakberegningsmodellene foreslo en logistisk vekst av miljøeksponeringen, med størst intensitet mellom 16. oktober og 4. November (Fig. 1).
nærhetsanalyseresultater
når nærhetsanalysen ble utført, var det 365 bekreftede tilfeller, hvorav 328 (90%) ble geo-referert til innenfor 10 km av en av de fire potensielle kildene (Fig. 5).
Legionærsykdom nær fire industrier med våte kjølesystemer etter bostedsavstand fra tårnet(e).
Alle fire potensielle kilder viste en signifikant nedgang i sykdomsrisiko med økende avstand (clustering) i SW-Kvadranten. Den høyeste klyngen (ST157,p
0,001) ble observert i sw-kvadranten av industri 1. Clustering ble også observert med industri 2 (ST 117, p0.001), industri 3 (ST 126, p0.001) og industri 4 (ST 66.1, p0.001). Risikoen for sykdom falt konsekvent med økende avstand fra kilden uten tegn på topper eller troughs i denne kvadranten. Ingen klynger ble observert I SE kvadranter av noen industri, et område som i stor grad består av elva. Industri 1 og 2 viste en lavere grad av clustering i ne-kvadranten (HENHOLDSVIS ST 5, p=0,01 og ST 4,2, p=0,01). Clustering ble også demonstrert I nw-kvadranten av industri 1 (ST 3.9, p=0.01).Diskusjon
vi identifiserte fire næringer med våtkjølesystem som de mest sannsynlige kildene til det nest største utbruddet Av Legionærsykdom registrert med 403 tilfeller og 14 dødsfall. Forhøyede konsentrasjoner Av L. pneumophila sg 1 ST1905 som demonstrerte den virulente MAb 3-1-undergruppen ble identifisert i tårnene i en industri. Ved HJELP AV SBT og WGS var vi i stand til å bekrefte den genetiske slektskap av utbruddsassosierte kliniske og miljømessige stammer. De eneste positive isolatene For l. pneumophila sg 1, ble begge hentet fra kjøletårnet til en industri. Lignende konsentrasjoner Av l. pneumophila har blitt isolert i andre kjøletårn forbundet med utbrudd.5 det er sannsynlig, selv om det ikke er bevist, at krysskontaminering av de fire nærliggende tårnene bidro til omfanget av utbruddet og tidligere har blitt beskrevet.21
de unseasonably varme temperaturene registrert i oktober 2014 støttet spredning Av Legionellae-arter i kjøletårnsystemer.22 de høye pm10-konsentrasjonene kan ha fungert som skykonsentrasjonskjerner som letter aerosoldannelsen. Fordelingen og det store antallet tilfeller forklares av NE-vind, høy relativ fuktighet og termisk inversjon observert i løpet av estimert frisettingsperiode i tillegg til longevity23 og økt virulens24 av en bakterie med epitop MAb3/1.
utbruddet skjedde i et tett befolket område nær Hovedstaden I Portugal som inneholdt tungt brukte pendlerruter fra forstadsområder. Det faktiske antallet eksponerte personer var sannsynligvis mye høyere enn beboerbefolkningen. Standard diagnostiske tester kan ikke oppdage alle tilfeller.3 tallene som presenteres inneholder ikke Tilfeller Av Pontiac feber eller mistenkte tilfeller som testet negativt og derfor sannsynligvis undervurderer sykelighet oppleves av samfunnet og innvirkning på lokale helsetjenester. I motsetning til tilstedeværelsen av elektronisk dødsmelding i Portugal, var det mulig å sikre at informasjon om hvorvidt en sak hadde dødd var fullført. Den observerte dødsulykken (3,5% av alle tilfeller) var lavere enn de 6% som vanligvis ble observert i utbrudd assosiert med kjøletårn og systemer.8 utbruddet kausative stamme fylogenetisk gruppert bortsett Fra de mest studerte utbrudd-assosiert l. pneumophila sg 1 stammer (Lp Philadelphia-1, Lp Paris, Lp Lens, Lp Corby, Og Lp 2300/99 Alcoy). Det ble funnet å være nært knyttet Til L. pneumophila subsp. fraseri stammer fra andre serogrupper enn sg 1. Den studerte stammen har en eksklusiv ∼38kb genomisk region sammenlignet med den nest mest fylogenetisk relaterte stammen. Denne regionen ble funnet å være intakt OG svært lik (BLASTn, dekke 100%, identitet 99%, e-verdi 0.0) bare I En stamme (ATCC 33761=DSM 21215) Av L. oakridgensis, en art som sjelden forårsaker Legionærsyken.25 Vi ville forklare den lave dødsfallet observert når det gjelder tidlig diagnose og hensiktsmessig og rettidig behandling, om de unike egenskapene til den utbruddsassosierte stammen ligger til grunn for viktige egenskaper ved dødelighet, forblir under studien.
nærhetsanalysen estimerte forventet antall tilfeller fra beboerbefolkningen, noe som sannsynligvis førte til en undervurdering av eksponering. Vi begrunnet at boliginformasjon ble samlet systematisk, i motsetning til forskyvningshistorie, var også forholdene for horisontal forplantning av aerosoler mer uttalt om natten da de fleste beboere ville ha vært i deres hjem. En mer robust tilnærming må utføre analysen som en del av en case control studie, som også kan inkludere eksponeringer hos ikke-bosatte. Selv om vi først diskuterte, fortsatte vi ikke med en case-control-studie på grunn av ressurs-og tidsbegrensninger. Den nære geografiske nærheten av tårnene betydde at det var overlapping av noen av studieområdene gjør det mulig, men usannsynlig at en tett plassert kilde kan føre til tilstedeværelse av en avstand nedgang forhold for en annen kilde. Sammenligning av geospatial distribusjon av tilfeller med plume modellering av aerosol kan være av verdi for å vurdere virkningen av nærliggende kilder på hverandre.
dette utbruddet var det nest største utbruddet Av Legionærsykdom registrert til dags dato, og legger til bevismaterialet om virkningen av klimatiske forhold og bakterielle fenotyper i kjøletårnassosierte samfunnsutbrudd Av Legionærsykdom.
Interessekonflikter
forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.