Inleiding
op 7 November 2014 werd het Directoraat-generaal Gezondheid in Portugal door een plaatselijk ziekenhuislaboratorium geïnformeerd over 18 patiënten met de Legionellaziekte, die allemaal in de voorafgaande 24 uur werden opgenomen Uit Vila Franca de Xira, een stad aan de rand van de hoofdstad Lissabon. Het werd al snel duidelijk dat het aantal gevallen toenam en dat er gevallen uit heel Portugal werden geïdentificeerd. Een multidisciplinaire taskforce onderzocht de uitbraak, de resultaten van hun vooronderzoek leidden tot de sluiting van industriële natte koelsystemen. Tijdens het onderzoek naar de uitbraak hebben we een rapport gepresenteerd dat is gepubliceerd als een snelle mededeling, met voorlopige gegevens over het epidemiologisch, microbiologisch en milieutechnisch onderzoek.1 Dit artikel bevat de definitieve resultaten van het onderzoek naar de uitbraak.Legionella ‘ s disease, voor het eerst beschreven tijdens de Philadelphia American Legion conference2 in 1976, is een bacteriële pneumonische infectie met Legionellaesoorten. De meeste gevallen die worden toegeschreven aan de ziekte van L. pneumophila sg 1.3 ontwikkelen zich kenmerkend 2-10 dagen na de inhalatie van aerosolized bacteriën door gevoelige personen. Risicofactoren zijn roken, oudere personen en mensen met chronische cardiorespiratoire ziekte.4 Water, zowel in natuurlijke als kunstmatige aquatische omgevingen, is het reservoir voor Legionellaesoorten.Tussen 2008 en 2012 werden jaarlijks tussen de 88 en 140 gevallen gemeld in Portugal, waarvan het merendeel sporadische door de gemeenschap verworven gevallen waren.6 grote uitbraken in de Gemeenschap kunnen in korte tijd leiden tot aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit,5 de grootste tot nu toe werd in 2001 gemeld in Murcia, Spanje, met 449 gevallen.7
vaak aangewezen als de bron van grote uitbraken in de Gemeenschap, kunnen industriële koeltorensystemen8 verontreinigde aërosolen over grote afstanden verspreiden.9 meteorologische factoren, industriële operationele omstandigheden en inadequaat onderhoud zijn risicofactoren voor Legionella-uitbraken in verband met torens.8,10
Methodendefinities
een bevestigd geval van Legionella’ s had tussen 12 oktober en 2 December 2014 radiologisch bevestigde pneumonie met aanvang van de symptomen, die woonde of werkte binnen 10 km van Vila Franca de Xira en een laboratoriumbevestiging van infectie had. De laboratoriumcriteria voor een bevestigd geval omvatten de isolatie van Legionella spp. uit respiratoire secreties, de detectie van L. pneumophila sg1 antigeen in urine, een significante stijging van het specifieke antilichaamniveau tegen L. pneumophila sg 1 in gepaarde serummonsters. We definieerden een waarschijnlijk geval dat alleen verschilde in de laboratoriumdetectie van beide Legionella spp. nucleïnezuur in respiratoire secreties of een enkel hoog niveau van specifiek antilichaam tegen L. pneumophila sg 1.
Identificatie van gevallen en beoordeling van blootstelling
gevallen werden geïdentificeerd door de wettelijke laboratorium-en elektronische klinische meldingen te herzien vanaf 1 oktober 2014. Personeel van regionale gezondheidsautoriteiten interviewde alle bevestigde en waarschijnlijke gevallen aan de hand van een standaardvragenlijst voor de ziekte van Portugese legionairs waarin demografische, epidemiologische en klinische gegevens werden geregistreerd. Het woonadres van elke zaak werd geocodeerd in Google Earth.
om sterfgevallen te identificeren, hebben we de uitbraak database regelmatig vergeleken met het Portugese real time information system for death certification (SICO), van November 2014 tot maart 2015.
Bronidentificatie
mogelijke bronnen van legionellaverontreiniging, waaronder industrieën met natte koelsystemen, ziekenhuizen, winkelcentra en openbare recreatievoorzieningen, werden geïdentificeerd en, als voorzorgsmaatregel, gesloten tot milieuonderzoek. De operationele en onderhoudsrapporten zijn gecontroleerd en de monsters zijn naar het screen genomen op de aanwezigheid van Legionella spp. de resultaten hebben geleid tot de identificatie van potentiële bronnen. De locaties van potentiële bronnen werden in kaart gebracht met behulp van visueel lokaliseren in Google Earth.
microbiologische, fenotypische en genotypische karakterisatie
detectie van L. pneumophila sg 1 antigeen werd uitgevoerd met behulp van specifieke urinaire antigeentests in ziekenhuislaboratoria. Ademhalings-en bloedmonsters werden verwerkt in het referentielaboratorium, het Nationaal Instituut voor gezondheid Dr Ricardo Jorge. Milieumonsters werden verkregen tijdens inspecties uitgevoerd door de Algemene Inspectie voor landbouw, zee, milieu en Ruimtelijke Ordening in overeenstemming met de Portugese regelgeving, en verwerkt door het referentielaboratorium, het Nationaal Instituut voor gezondheid Dr.Ricardo Jorge.
klinische en milieumonsters werden geanalyseerd met behulp van kweek-en/of moleculaire technieken. Klinische monsters werden gekweekt op bcye-gebaseerde media en milieumonsters werden gekweekt in gvpc selectieve media. Isolaten zijn geïdentificeerd met commerciële latexagglutinatiekits (Legionella latex Test, Oxoid, Verenigd Koninkrijk en Microgen Legionella, Microgen® Bioproducts,). Kweekresultaten voor klinische monsters werden gecontroleerd met real-time PCR gericht op de 16S en/of mip genen (L. pneumophila Real-TM, Sacace Biotechnologies, Italië; Argene Legio pneumo / Cc r-gen, bioMérieux, Frankrijk). Isolaten of kweeknegatieve/PCR-positieve monsters werden gekarakteriseerd door sequentiegebaseerde typering (SBT) overeenkomstig de richtsnoeren van de European Working Group for Legionella Infections (EWGLI).11 de zeven loci werden onderworpen aan Sanger rangschikken door bigdye v1.1 chemie op een 3130xl genetische Analyzer (Toegepaste Biosystems) te gebruiken. Het gehele genoom rangschikken (WGS) werd uitgevoerd voor 10 klinische en één milieusteekproef op een MiSeq-instrument (Illumina Inc., San Diego, USA) met behulp van MiSeq v2-stroomcellen en 150bp gepaarde uiteinden (dekkingsdiepte >100-voudig) om hun gelijkenis vast te stellen. Illumina reads werden samengesteld met behulp van fluweel versie 1.2.10.12
fenotypische karakterisering van L. pneumophila sg1 gebruikte het Dresden panel van monoklonale antilichamen (MAbs) bestaande uit zes MAbs plus de MAb 3 van het International Panel verkregen uit de American Type Culture Collection (ATCC). De analyse volgde een vastgesteld algoritme, onderschreven door EWGLI dat L. pneumophila kan karakteriseren in een van de negen subgroepen; Knoxville, Philadelphia, Frankrijk/Allentown, Benidorm, OLDA, Oxford, Heysham, Camperdown en Bellingham.Het panel omvatte antilichamen tegen MAb 3/1, dat wordt beschouwd als een virulentiemarker vanwege hoge hydrofobiciteit van deze stammen.Meteorologische en luchtkwaliteitsaspecten
gegevens werden verkregen van het weerstation in Vila Franca de Xira en het plaatselijke luchtkwaliteitsstation (Alverca). Voor de periode van 18 oktober–1 November 2014 werden tweemaal per dag opnames van temperatuur en eenmaal per dag opnames van vochtigheid, luchtkwaliteit, windsnelheid en-richting verzameld.
statistische analyse
we hebben een nabijheidsanalyse uitgevoerd van vier potentiële bronnen om de hypothese te testen dat het risico op ziekte omgekeerd gerelateerd was aan de afstand tot de bron. Met behulp van QGIS-software werd een buffer van een straal van 10 km, verder onderverdeeld in concentrische ringen van 1 km, geplaatst op de torens van elk industrieel koelsysteem. De buffer en ringen werden vervolgens verdeeld in vier kwadranten, North East, South East en North West. We hebben het aantal gevallen vergeleken met de verwachte aantallen. Om de verwachte gevallen te berekenen, werden leeftijd en geslacht specifieke percentages voor de uitbraak toegepast op de subsectie bevolkingsaantallen van de volkstelling van 2011. Subsecties werden ingedeeld volgens de afstand en richting van hun geografische centrum van elke bron. Het verwachte aantal gevallen voor elk bandkwadrant werd berekend als de som van de verwachte gevallen voor de onderafdelingen waarvan de centroïden erin lagen. Met behulp van Stones ‘Test (ST) testten we waargenomen tot verwachte ratio’ s voor daling van het risico, met een afstand tot 10km in het noordoosten, noordwesten, zuidoosten en Zuidwest14 met 9999 Monte Carlo simulaties en stelden we de cut-off voor statistische significantie op 0,05.15
terug berekeningsmodellen ontwikkeld door Egan et al.16 werden gebruikt om de periode van aërosolisatie bij het begin van de uitbraak te schatten. De modellen werden herhaald in gevallen die tot maart 2015 waren aangemeld. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van R statistische software.
Resultsoutbeschrijving
op 2 December 2014 werden 403 ziektegevallen geïdentificeerd, waarvan 377 bevestigde en 26 waarschijnlijke gevallen. Veertien mensen stierven (overlijden 3,5%).
bevestigd geval ontwikkelde symptomen tussen 14 oktober en 2 December 2014. Het aantal gevallen bereikte op 6 November een hoogtepunt en de uitbraak werd op 7 November gemeld (Fig. 1).
bevestigde gevallen van Legionellasziekte per datum van aanvang van de symptomen, Vila Franca de Xira, Portugal, 14 oktober-2 December 2014 (n=377).
de hoogste aanvallen werden gezien in de parochie van Póvoa de Santa Iria / Forte De Casa (60 per 10.000 inwoners) en daalde met toenemende afstand van deze parochie (Fig. 2).
kaart met het aantal aanvallen van Legionella ‘ s per woonplaats (parochie), Vila Franca de Xira, Portugal.
er waren 252 bevestigde gevallen bij mannen (66%). De mediane leeftijd was 59 jaar, het aantal aanvallen was hoger bij mannen en nam toe met de leeftijd bij beide geslachten (25,1 per 10.000 mannen in de leeftijd van 20-64 jaar versus 37,9 per 10.000 mannen ouder dan 65) en vrouwen (9,0 per 10.000 vrouwen in de leeftijd van 20-64 jaar versus 26,1 gevallen per 10.000 vrouwen ouder dan 65).
tweehonderd acht (55%) bevestigde gevallen meldden ook een verhoogde vatbaarheid voor de ziekte, het vaakst als gevolg van roken en chronische cardio-respiratoire aandoeningen.
Bronidentificatie
negenenveertig mogelijke bronnen; binnenlandse, publieke, commerciële en industriële (5) werden geïdentificeerd en teruggebracht tot vier Potentiële Bronnen na milieuonderzoek. Alle vier waren industrieën met natte koelsystemen.
drie van de vier potentiële bronnen meldden vermoede gevallen bij werknemers, negen gevallen werden bevestigd.
microbiologische en fenotypische analyse en genetische karakterisatie
het referentielaboratorium ontving 95 milieumonsters uit 49 mogelijke bronnen, waarvan L. pneumophila positieve culturen werden geïsoleerd in 8. Deze monsters zijn afkomstig uit vier industrieën met natte koelsystemen en een commerciële ruimte. Zes van de acht positieve culturen waren L. pneumophila sg 2-15 (75%). L. pneumophila sg 1 werden geïsoleerd uit twee milieumonsters uit dezelfde toren van één industrieel systeem; de geregistreerde concentraties bedroegen 1,42×106ufc/l op 8 November en 421ufc/l op 10 November. Sequence-based typering van deze twee omgevingsisolaten identificeerde het nieuwe genotype ST1905.
laboratoriumbevestiging van de gevallen werd gedaan door; urinair antigeentest op L. pneumophila sg 1 (92%); seroconversie (2%); PCR (3%) en unieke titer voor L. pneumophila (3%). 152 klinische monsters werden naar het referentielaboratorium gestuurd. Uit 71 bleek de aanwezigheid van L. pneumophila sg 1 met identiek st1905 SBT-profiel.
37 isolaten van L. pneumophila sg 1 ondergingen een fenotypische karakterisering, 35 isolaten uit klinische monsters en twee uit milieumonsters. Alle 37 isolaten vertoonden dezelfde fenotypische eigenschap; subtype Frankrijk / Allentown en bezaten het virulentie-geassocieerde epitoop dat wordt herkend door monoklonaal antilichaam MAb 3/1 (Fig. 3).
Microbiolologische verwerking en resultaten van klinische specimens.
om de genetische verwantschap van st1905-isolaten te bevestigen, werden 10 van de 71 klinische isolaten en één milieupositief isolaat verkregen uit de industriële koeltoren nominaal geselecteerd voor volledige genoomsequencing. We konden ongeveer 99 gebruiken.8% van elke ontwerpopeenvolging en vond geen nucleotideverschillen binnen vergeleken 3.47 Mb van het genoom. Fylogenetische analyse waarbij meerdere L. pneumophila isolaten van over de hele wereld betrokken waren, toonde aan dat de st1905 cluster duidelijk divergeerde van de tak die de meest bestudeerde L. pneumophila stammen (serogroepen 1, 6 en 12)17-19 registreerde en nauwer verwant was met L. pneumophila subsp. fraseri stammen (serogroep 4, 5 en 15).20 WGS bevestiging van de st1905 allelic profiel gemarkeerd een bias geassocieerd met de in silico extractie van de allel sequentie voor de mompS locus. De bestudeerde stam vertoonde niet-overeenkomende mompS-kopieën, die een goede St-attributie belemmerden als SBT uitsluitend werd bepaald in silico (Fig. 4).
fylogenetische boom die de gehele genoomsequentie van omgevingsisolaten en klinische isolaten vergelijkt.
meteorologische, klimaat–en luchtkwaliteitsresultaten
temperaturen boven het maandgemiddelde werden geregistreerd van 18 oktober tot 1 November (>20°C), met een aanhoudende nachtelijke thermische inversie geassocieerd met een overheersende NE en NNE wind met een snelheid van 2-3 km/u. De laatste week van oktober had meer dan 80% relatieve vochtigheid, met perioden van meer dan 90%. Oktober 2014 was de warmste oktober in het vasteland van Portugal sinds 1931, met inbegrip van een 11 dagen hittegolf tijdens de periode 17-27 oktober. Van 19 oktober tot 1 November werd in het plaatselijke luchtkwaliteitsstation driemaal het aanbevolen gehalte aan fijn stof (PM10) en de hoogste wekelijkse waarden in 2014 geregistreerd, wat wordt toegeschreven aan een sterke episode van Sahara-stof dat naar het vasteland van Portugal werd getransporteerd.
evaluatieperiode
de best passende back-calculatiemodellen suggereerden een logistieke groei van de blootstelling aan het milieu, met de grootste intensiteit tussen 16 oktober en 4 November (Fig. 1).
resultaten van de bronproximiteitsanalyse
toen de bronproximiteitsanalyse werd uitgevoerd, waren er 365 bevestigde gevallen, waarvan 328 (90%) geolocatie hadden tot op minder dan 10 km van een van de vier potentiële bronnen (Fig. 5).
alle vier de mogelijke bronnen toonden een significante afname van het ziekterisico aan met toenemende afstand (clustering) in het ZW-kwadrant. De hoogste clustering (ST157, p
0,001) werd waargenomen in het SW kwadrant van industrie 1. Clustering werd ook waargenomen bij industrie 2 (st 117, p0.001), industrie 3 (ST 126, p0.001) en industrie 4 (ST 66.1, p0.001). Het risico op ziekte daalde consistent met toenemende afstand van de bron zonder bewijs van pieken of dalen in dit kwadrant. Er werd geen clustering waargenomen in de se kwadranten van enige industrie, een gebied dat grotendeels bestond uit de rivier. Industrie 1 en 2 vertoonden een lagere graad van clustering in het ne kwadrant (respectievelijk st 5, p=0,01 en St 4,2, p=0,01). Clustering werd ook aangetoond in het NW kwadrant van industrie 1 (ST 3,9, p=0,01).Discussie
we hebben vier industrieën met een nat koelsysteem geïdentificeerd als de meest waarschijnlijke oorzaak van de op een na grootste uitbraak van Legionellaziekte, met 403 gevallen en 14 sterfgevallen. Verhoogde concentraties L. pneumophila sg 1 ST1905 die de virulente MAb 3-1-subgroep demonstreerde, werden geïdentificeerd in de torens van één industrie. Met behulp van SBT en WGS, konden we de genetische verwantschap bevestigen van de uitbraak-geassocieerde klinische en omgevingsstammen. De enige positieve isolaten voor L. pneumophila sg 1 werden beide verkregen uit de koeltoren van één industrie. Vergelijkbare concentraties van L. pneumophila zijn geïsoleerd in andere koeltorens die geassocieerd zijn met uitbraken.5 Het is waarschijnlijk, hoewel niet bewezen dat kruisbesmetting van de vier nauw gelegen torens heeft bijgedragen aan de omvang van de uitbraak en is eerder beschreven.21
de in oktober 2014 geregistreerde ongewoon warme temperaturen hebben de verspreiding van Legionellasoorten in koeltorensystemen ondersteund.De hoge PM10-concentraties zouden kunnen hebben gefunctioneerd als wolkenconcentratiekernen die aerosolvorming mogelijk maakten. De verdeling en het grote aantal gevallen zijn toe te schrijven aan de ne wind, hoge relatieve vochtigheid en thermische inversie waargenomen tijdens de geschatte release periode naast de levensduur 23 en verhoogde virulentie24 van een bacterie met epitope MAb3/1.
de uitbraak vond plaats in een dichtbevolkt gebied in de buurt van de hoofdstad van Portugal met veel gebruikte forenzenroutes vanuit voorsteden. Het werkelijke aantal blootgestelde personen was waarschijnlijk veel hoger dan de inwonende bevolking. Standaard diagnostische tests kunnen niet alle gevallen detecteren.3 de gepresenteerde cijfers bevatten geen gevallen van Pontiac koorts of vermoede gevallen die negatief testten en onderschatten daarom waarschijnlijk de morbiditeit van de Gemeenschap en de impact op de lokale gezondheidsdiensten. In tegenstelling tot de aanwezigheid van een elektronische overlijdensmelding in Portugal kon ervoor worden gezorgd dat de informatie over de vraag of een zaak was overleden volledig was. Het aantal gevallen van overlijden (3,5% van alle gevallen) was lager dan de 6% die gewoonlijk werd waargenomen bij uitbraken in verband met koeltorens en-systemen.8 de uitbraak causatieve stam fylogenetisch geclusterd afgezien van de meest bestudeerde uitbraak-geassocieerde L. pneumophila sg 1 stammen (Lp Philadelphia-1, Lp Paris, Lp Lens, Lp Corby, en Lp 2300/99 Alcoy). Het bleek nauw verwant te zijn aan L. pneumophila subsp. fraseri stammen van andere serogroepen dan sg 1. De bestudeerde stam herbergt een exclusief gen 38kb genomic gebied vergeleken met de volgende meest fylogenetisch verwante stam. Dit gebied bleek intact en zeer vergelijkbaar te zijn (BLASTn, dekking 100%, identiteit 99%, E-waarde 0,0) bij slechts één stam (ATCC 33761=DSM 21215) van L. oakridgensis, een soort die zelden Legionella ‘ s ziekte veroorzaakt.25 we zouden het lage sterftecijfer in termen van vroegtijdige diagnose en geschikte en tijdige behandeling kunnen verklaren, en of de unieke kenmerken van de met de uitbraak samenhangende stam aan belangrijke kenmerken van de letaliteit ten grondslag liggen, nog in onderzoek is.
de bronproximiteitsanalyse schatte het verwachte aantal gevallen van de ingezeten bevolking, wat waarschijnlijk leidde tot een onderschatting van de blootstelling. We redeneerden dat residentiële informatie systematisch werd verzameld, in tegenstelling tot verplaatsing geschiedenis, ook de voorwaarden voor de horizontale voortplanting van aërosolen waren meer uitgesproken ‘ s nachts wanneer de meeste bewoners in hun huizen zou zijn geweest. Een robuustere aanpak zou de analyse moeten uitvoeren als onderdeel van een casestudy, die ook blootstellingen bij niet-ingezetenen zou kunnen omvatten. Hoewel in eerste instantie besproken, hebben we niet verder gegaan met een case–control studie als gevolg van middelen en tijd beperkingen. De nauwe geografische nabijheid van de torens betekende dat er overlapping van een aantal van de studiegebieden waardoor het mogelijk, maar onwaarschijnlijk dat een nauw gelegen bron kon leiden tot de aanwezigheid van een afstand verval relatie voor een andere bron. Het vergelijken van de geospatiale verdeling van cases met pluimmodellering van aërosols kan van nut zijn om de impact van nauw gelegen bronnen op elkaar te beoordelen.
deze uitbraak was de op één na grootste uitbraak van de Legionellaziekte die tot nu toe is geconstateerd en vormt een aanvulling op de gegevens over het effect van klimatologische omstandigheden en bacteriële fenotypen in met koeltoren geassocieerde communautaire uitbraken van de Legionellaziekte.
belangenconflicten
de auteurs hebben geen belangenconflicten aan te geven.