wprowadzenie
w dniu 7 listopada 2014 r.Dyrekcja Generalna ds. zdrowia w Portugalii została poinformowana przez lokalne laboratorium szpitalne obejmujące 18 pacjentów z chorobą legionistów, wszystkich przyjętych w ciągu poprzednich 24 godzin z Vila Franca de Xira, miasta na obrzeżach stolicy Lizbony. Szybko okazało się, że liczba przypadków rośnie i przypadki zostały zidentyfikowane z całej Portugalii. Multidyscyplinarna grupa zadaniowa zbadała epidemię, wyniki wstępnego dochodzenia doprowadziły do zamknięcia przemysłowych mokrych systemów chłodzenia. Podczas badania epidemiologicznego przedstawiliśmy raport, który został opublikowany jako szybki komunikat, dostarczający wstępnych danych z badań epidemiologicznych, mikrobiologicznych i środowiskowych.1 artykuł przedstawia ostateczne Wyniki badania ognisk ogniskowych.
choroba legionistów, po raz pierwszy opisana podczas Philadelphia American Legion conference2 w 1976 roku, jest bakteryjną infekcją pneumoniczną z gatunkami Legionellae. Większość przypadków przypisywanych chorobie L. pneumophila sg 1.3 rozwija się charakterystycznie 2-10 dni po inhalacji aerozolizowanych bakterii przez podatne osoby. Czynniki ryzyka obejmują palenie tytoniu, osoby starsze i osoby z przewlekłą chorobą serca.4 woda, zarówno w naturalnym, jak i sztucznym środowisku wodnym, jest rezerwuarem dla gatunków Legionellae.5
w latach 2008-2012 w Portugalii zgłaszano rocznie od 88 do 140 przypadków, z których większość stanowiła sporadyczne przypadki nabyte we Wspólnocie.6 duże ogniska we Wspólnocie mogą prowadzić do znacznej zachorowalności i śmiertelności w krótkim czasie,5 NAJWIĘKSZY JAK DOTĄD odnotowano w 2001 r.w Murcji w Hiszpanii, gdzie odnotowano 449 przypadków.7
przemysłowa wieża chłodnicza source8, często określana jako źródło ognisk ognisk na dużą skalę, jest w stanie rozpowszechniać zanieczyszczone aerozole na duże odległości.9 czynniki meteorologiczne, przemysłowe warunki operacyjne i nieodpowiednia konserwacja są czynnikami ryzyka wystąpienia ognisk Legionelli związanych z wieżami.8,10
Metodydefinicje
potwierdzony przypadek choroby legionistów miał radiologicznie potwierdzone zapalenie płuc z objawami pojawiającymi się między 12 października a 02 grudnia 2014, który mieszkał lub pracował w odległości 10 km od Vila Franca de Xira i miał laboratoryjne potwierdzenie zakażenia. Kryteria laboratoryjne potwierdzonego przypadku obejmowały izolację bakterii Legionella spp. z wydzielin oddechowych, wykrywanie L. antygen pneumophila sg1 w moczu, znaczący wzrost swoistego poziomu przeciwciał przeciwko L. pneumophila sg 1 w sparowanych próbkach surowicy. Zdefiniowaliśmy prawdopodobny przypadek różniący się tylko laboratoryjnym wykrywaniem Legionella spp. kwas nukleinowy w wydzielinie oddechowej lub pojedynczy wysoki poziom swoistego przeciwciała przeciwko L. pneumophila sg 1.
Identyfikacja przypadków i ocena narażenia
przypadki zostały zidentyfikowane poprzez przegląd ustawowych laboratoryjnych i elektronicznych powiadomień klinicznych od dnia 1 października 2014 r. Pracownicy regionalnych organów ds. zdrowia przeprowadzili wywiady ze wszystkimi potwierdzonymi i prawdopodobnymi przypadkami, stosując standardowy kwestionariusz choroby legionistów portugalskich, w którym zarejestrowano dane demograficzne, epidemiologiczne i kliniczne. Adres zamieszkania każdej sprawy został geokodowany w Google Earth.
aby zidentyfikować zgony, od listopada 2014 r.do marca 2015 r. regularnie porównywaliśmy bazę danych epidemii z portugalskim systemem informacji w czasie rzeczywistym dla certyfikacji śmierci (SICO).
identyfikacja Źródła
zidentyfikowano możliwe źródła zanieczyszczenia Legionellą, w tym Przemysł z mokrymi systemami chłodzenia, szpitale, centra handlowe i publiczne obiekty rekreacyjne i, jako środek ostrożności, Zamknięto do czasu badania środowiskowego. Sprawdzono raporty dotyczące eksploatacji i konserwacji oraz pobrano próbki do badań przesiewowych na obecność Legionella spp., wyniki doprowadziły do identyfikacji potencjalnych źródeł. Lokalizacje potencjalnych źródeł zostały zmapowane za pomocą wizualnego identyfikowania w Google Earth.
charakterystyka mikrobiologiczna, fenotypowa i genotypowa
wykrywanie antygenu L. pneumophila sg 1 wykonywano w szpitalnych laboratoriach przy użyciu specyficznych testów na obecność antygenu w moczu. Próbki układu oddechowego i krwi były przetwarzane w laboratorium referencyjnym, Narodowym Instytucie Zdrowia dr Ricardo Jorge. Próbki środowiskowe zostały uzyskane podczas kontroli przeprowadzonych przez Generalny Inspektorat Rolnictwa, morza, środowiska i Planowania Przestrzennego zgodnie z portugalskimi przepisami i przetworzone przez laboratorium referencyjne Narodowego Instytutu Zdrowia dr Ricardo Jorge.
próbki kliniczne i środowiskowe analizowano przy użyciu hodowli i / lub technik molekularnych. Próbki kliniczne hodowano na nośnikach opartych na BCEE, a próbki środowiskowe hodowano w nośnikach selektywnych gvpc. Izolaty zidentyfikowano za pomocą komercyjnych zestawów do aglutynacji lateksowej (Legionella latex Test, Oxoid, United Kingdom and Microgen Legionella, Microgen ® Bioproducts,). Wyniki hodowli próbek klinicznych sprawdzano metodą PCR w czasie rzeczywistym ukierunkowaną na geny 16S i/lub mip (L. pneumophila Real-TM, Sacace Biotechnologies, Włochy; Argene Legio pneumo / CC R-gene, bioMérieux, Francja). Izolaty lub próbki z ujemnym wynikiem hodowli/dodatnim wynikiem PCR charakteryzowano metodą typowania opartego na sekwencjach (SBT) zgodnie z wytycznymi Europejskiej Grupy Roboczej ds. zakażeń Legionellą (EWGLI).11 siedem loci poddano sekwencjonowaniu Sangera przy użyciu chemii BigDye v1.1 na analizatorze genetycznym 3130xl (Applied Biosystems). Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) przeprowadzono dla 10 próbek klinicznych i jednej próbki środowiskowej na instrumencie MiSeq (Illumina Inc., San Diego, USA) przy użyciu komórek przepływowych MiSeq V2 i sparowanych odczytów końcowych 150bp (głębokość pokrycia > 100-krotnie) w celu ustalenia ich podobieństwa. Odczyty Illumina zostały zmontowane przy użyciu Velvet w wersji 1.2.10.12
. pneumophila sg1 wykorzystała Panel Dresdena z przeciwciałami monoklonalnymi (MAbs) składający się z sześciu MAbs plus MAb 3 z Panelu Międzynarodowego uzyskanego z kolekcji American Type Culture Collection (ATCC). Analiza przebiegała według ustalonego algorytmu, zatwierdzonego przez EWGLI, który może scharakteryzować L. pneumophila na jedną z dziewięciu podgrup; Knoxville, Philadelphia,France / Allentown, Benidorm, OLDA, Oxford, Heysham, Camperdown i Bellingham.Panel zawierał przeciwciała przeciwko MAb 3/1, które uważa się za marker zjadliwości ze względu na wysoką hydrofobowość tych szczepów.
aspekty meteorologiczne i jakość powietrza
dane uzyskano ze stacji meteorologicznej w Vila Franca de Xira i lokalnej stacji jakości powietrza (Alverca). W okresie od 18 października do 1 listopada 2014 roku zbierano dwa razy dziennie rejestracje temperatury oraz raz dziennie rejestracje wilgotności, jakości powietrza, prędkości i kierunku wiatru.
analiza statystyczna
przeprowadziliśmy analizę bliskości źródeł czterech potencjalnych źródeł, aby sprawdzić hipotezę, że ryzyko choroby było odwrotnie związane z odległością od źródła. Wykorzystując oprogramowanie QGIS, bufor o promieniu 10 km podzielony na koncentryczne pierścienie o promieniu 1 km został umieszczony na wieżach każdego przemysłowego systemu chłodzenia. Bufor i pierścienie zostały następnie podzielone na cztery ćwiartki: północny wschód, południowy wschód, południowy zachód i północny zachód. Porównaliśmy liczbę spraw z oczekiwanymi liczbami. Aby obliczyć spodziewane przypadki, do podsekcji liczby ludności ze Spisu Powszechnego z 2011 r.zastosowano wskaźniki specyficzne dla wieku i płci ogniska. Podrozdziały zostały podzielone według odległości i kierunku ich geograficznego centroidu od każdego źródła. Oczekiwana liczba przypadków dla każdego kwadrantu pasma została obliczona jako suma oczekiwanych przypadków dla podsekcji, których centroidy leżą w jej obrębie. Korzystając z testu Stonesa (St), przetestowaliśmy obserwowane do oczekiwanych współczynniki spadku ryzyka, z odległością do 10 km w północno-wschodniej, północno-zachodniej,Południowo-Wschodniej i Południowo-Zachodniej14 za pomocą symulacji Monte Carlo 9999 i ustawiliśmy granicę istotności statystycznej na 0,05,15
Wstecz modele obliczeniowe opracowane przez Egan et al.16 wykorzystano do oszacowania okresu uwalniania aerozoli na początku epidemii. Modele były powtarzane w przypadkach zgłoszonych do marca 2015 roku. Analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania r statistical.
Wynikiopis choroby
do 2 grudnia 2014 zidentyfikowano 403 przypadki choroby, z czego 377 potwierdzonych i 26 prawdopodobnych. Zginęło czternaście osób (śmiertelność 3,5%).
potwierdzono wystąpienie objawów między 14 października a 2 grudnia 2014 r. Liczba przypadków osiągnęła szczyt w dniu 6 listopada, a ognisko zostało ogłoszone w dniu 7 listopada (rys. 1).
potwierdzone przypadki choroby legionistów według daty wystąpienia objawów, Vila Franca de Xira, Portugalia, 14 października–2 grudnia 2014 r. (n=377).
najwyższe wskaźniki ataku odnotowano w parafii Póvoa de Santa Iria / Forte de Casa (60 na 10 000 mieszkańców) i spadały wraz ze wzrostem odległości od tej parafii(rys. 2).
Mapa pokazująca wskaźnik ataku choroby legionistów według miejsca zamieszkania (Parafia), Vila Franca de Xira, Portugalia.
stwierdzono 252 potwierdzone przypadki u mężczyzn (66%). Mediana wieku wynosiła 59 lat, wskaźnik ataku był wyższy u mężczyzn i wzrastał wraz z wiekiem u obu płci (25,1 na 10 000 mężczyzn w wieku 20-64 lat wobec 37,9 na 10 000 mężczyzn w wieku powyżej 65 lat) i kobiet (9,0 na 10 000 kobiet w wieku 20-64 lat wobec 26,1 przypadków na 10 000 kobiet w wieku powyżej 65 lat).
dwieście osiem (55%) potwierdzonych przypadków zgłosiło również zwiększoną podatność na choroby, najczęściej z powodu palenia tytoniu i przewlekłej choroby układu oddechowego.
identyfikacja Źródła
czterdzieści dziewięć możliwych źródeł; krajowe, publiczne, handlowe i przemysłowe (5) zidentyfikowano i zredukowano do czterech potencjalnych źródeł w wyniku badania środowiskowego. Wszystkie cztery były przemysłami z mokrymi systemami chłodzenia.
trzy z czterech potencjalnych źródeł zgłosiły podejrzane przypadki wśród pracowników, dziewięć przypadków zostało potwierdzonych.
analiza mikrobiologiczna i fenotypowa oraz charakterystyka genetyczna
laboratorium referencyjne otrzymało 95 próbek środowiskowych z 49 możliwych źródeł, z których dodatnie Kultury L. pneumophila wyizolowano w 8. Próbki te pochodzą z czterech branż z mokrymi systemami chłodzenia i jednym lokalem handlowym. Sześć z 8 dodatnich kultur to L. pneumophila sg 2-15 (75%). L. pneumophila sg 1 wyizolowano z dwóch próbek środowiskowych pobranych z tej samej wieży jednego systemu przemysłowego, odnotowane stężenia wynosiły 1,42×106ufc/l w dniu 8 listopada i 421ufc / L w dniu 10 listopada. Typowanie na podstawie sekwencji tych dwóch izolatów środowiskowych zidentyfikowało nowy genotyp ST1905.
laboratoryjne potwierdzenie przypadków zostało wykonane przez; badanie antygenu w moczu na obecność L. pneumophila sg 1 (92%); serokonwersja (2%); PCR (3%) i niepowtarzalne miano L. pneumophila (3%). Do laboratorium referencyjnego wysłano 152 próbki kliniczne. Spośród nich 71 wykazało obecność L. pneumophila sg 1 o identycznym profilu ST1905 SBT.
37 izolatów L. pneumophila sg 1 poddano charakterystyce fenotypowej, 35 izolatów z próbek klinicznych i dwie z próbek środowiskowych. Wszystkie 37 izolatów prezentowało tę samą charakterystykę fenotypową; Podtyp France / Allentown i posiadało epitop związany z zjadliwością rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne MAb 3/1 (Fig. 3).
przetwarzanie mikrobiologiczne i wyniki badań klinicznych.
aby potwierdzić genetyczną pokrewieństwo izolatów ST1905, nominalnie wybrano 10 z 71 izolatów klinicznych i jeden pozytywny izolat środowiskowy otrzymany z przemysłowej wieży chłodniczej do sekwencjonowania całego genomu. Udało nam się użyć około 99.8% każdej sekwencji projektowej i nie stwierdzono różnic nukleotydowych w porównaniu z 3,47 Mb genomu. Analiza filogenetyczna obejmująca wiele izolatów L. pneumophila z całego świata wykazała, że klaster st1905 wyraźnie odbiegał od gałęzi obejmującej najczęściej badane szczepy L. pneumophila (serogrupy 1, 6 i 12)17-19 i był bliżej spokrewniony z L. pneumophila subsp. szczepy fraseri (serogrupy 4, 5 i 15).20 WGS potwierdzenie profilu allelicznego ST1905 uwydatniło błąd związany z ekstrakcją sekwencji alleli in silico dla locus mompS. Badany szczep wykazywał niepasujące kopie mompS, co utrudniało prawidłowe przypisanie ST, jeśli SBT oznaczano wyłącznie w silico (Fig. 4).
drzewo filogenetyczne porównujące całą sekwencję genomu izolatów środowiskowych i klinicznych.
wyniki meteorologiczne, klimatyczne i jakość powietrza
temperatury przekraczające średnią miesięczną odnotowano od 18 października do 1 listopada (> 20°c), z utrzymującą się nocną inwersją termiczną związaną z dominującym wiatrem NE i NNE z prędkością 2-3 km/h. W ostatnim tygodniu października wilgotność względna przekraczała 80%, a okresy przekraczały 90%. Październik 2014 był najcieplejszym październikiem w kontynentalnej Portugalii od 1931 roku, w tym 11-dniową falą upałów w okresie 17-27 października. Od 19 października do 1 listopada trzykrotnie zalecany poziom pyłu zawieszonego (PM10) i najwyższe tygodniowe wartości w 2014 r.odnotowano w lokalnej stacji jakości powietrza, co przypisano silnemu epizodowi pyłu Sahary transportowanego do kontynentalnej Portugalii.
okres oceny narażenia
najlepiej dopasowane modele obliczeń wstecznych sugerowały logistyczny wzrost narażenia w środowisku, z największą intensywnością między 16 października a 4 listopada (rys. 1).
wyniki analizy bliskości Źródła
gdy przeprowadzono analizę bliskości źródła, potwierdzono 365 przypadków, z których 328 (90%) było odniesieniami geograficznymi w odległości 10 km od jednego z czterech potencjalnych źródeł (Fig. 5).
choroba legionistów w pobliżu czterech branż z mokrymi systemami chłodzenia według odległości zamieszkania od wieży(s).
wszystkie cztery potencjalne źródła wykazały znaczny spadek ryzyka choroby wraz ze wzrostem odległości (klastrowania) w kwadrancie SW. Najwyższe skupiska (ST157, p
0,001) zaobserwowano w kwadrancie SW przemysłu 1. Klastrowanie zaobserwowano również w przypadku przemysłu 2 (ST 117, p0.001), przemysłu 3 (St 126, p0.001) I przemysłu 4 (ST 66.1, p0.001). Ryzyko zachorowania spadało konsekwentnie wraz ze wzrostem odległości od źródła, bez dowodów na piki lub koryta w tym kwadrancie. Nie zaobserwowano skupiania się w kwadrantach SE żadnego przemysłu, obszar, który w dużej mierze składał się z rzeki. Przemysł 1 i 2 wykazały niższy stopień grupowania w kwadrancie NE (ST 5, P=0, 01 i ST 4, 2, P=0, 01 odpowiednio). Klastrowanie wykazano również w kwadrancie NW przemysłu 1 (ST 3,9, p=0,01).Dyskusja
zidentyfikowaliśmy cztery branże z mokrym systemem chłodzenia jako najbardziej prawdopodobne źródła drugiego co do wielkości wybuchu choroby legionistów zarejestrowanego z 403 przypadkami i zgonami 14. Podwyższone stężenie L. pneumophila sg 1 ST1905 wykazująca zjadliwą podgrupę MAb 3-1 została zidentyfikowana w wieżach jednego przemysłu. Używając SBT i WGS, byliśmy w stanie potwierdzić genetyczną relację szczepów klinicznych i środowiskowych związanych z epidemią. Jedyne dodatnie Izolaty dla L. pneumophila sg 1 uzyskano z wieży chłodniczej jednego przemysłu. Podobne stężenia L. pneumophila zostały wyizolowane w innych chłodniach kominowych związanych z ogniskami.5 jest prawdopodobne, choć nie udowodniono, że zanieczyszczenie krzyżowe czterech ściśle zlokalizowanych wież przyczyniło się do wielkości epidemii i zostało wcześniej opisane.21
niespotykanie wysokie temperatury odnotowane w październiku 2014 r.sprzyjały rozprzestrzenianiu się gatunków Legionellae w systemach wież chłodniczych.22 wysokie stężenia PM10 mogły działać jako jądra koncentracji chmur ułatwiające tworzenie aerozolu. Za dystrybucję i dużą liczbę przypadków odpowiada wiatr NE, wysoka wilgotność względna i inwersja termiczna obserwowane w szacowanym okresie uwalniania, a także długowieczność i podwyższona zjadliwość24 bakterii z epitopem mab3 / 1.
wybuch epidemii nastąpił na gęsto zaludnionym obszarze w pobliżu stolicy Portugalii, gdzie często wykorzystywane są trasy dojazdowe z obszarów podmiejskich. Rzeczywista liczba osób narażonych była prawdopodobnie znacznie wyższa niż populacja rezydentów. Standardowe testy diagnostyczne mogą nie wykryć wszystkich przypadków.3 przedstawione dane liczbowe nie zawierają przypadków gorączki Pontiaca ani podejrzanych przypadków, w których wynik testu był negatywny, a zatem prawdopodobnie nie doceniają zachorowalności doświadczanej przez społeczność i wpływu na lokalną służbę zdrowia. W przeciwieństwie do tego, ze względu na obecność elektronicznego powiadomienia o śmierci w Portugalii, możliwe było zapewnienie kompletności informacji o tym, czy dana sprawa zmarła. Obserwowana śmiertelność (3,5% wszystkich przypadków) była niższa niż 6% zwykle obserwowana w ogniskach związanych z wieżami chłodniczymi i systemami.8 szczep wywołujący ognisko skupiał się filogenetycznie poza najbardziej badanymi szczepami L. pneumophila sg 1 (Lp Philadelphia-1, Lp Paris, Lp Lens, Lp Corby i Lp 2300/99 Alcoy). Stwierdzono, że jest blisko spokrewniony z L. pneumophila subsp. szczepy fraseri z serogrup innych niż sg 1. Badany szczep zawiera ekskluzywny ∼38kb region genomowy w porównaniu z następnym najbardziej filogenetycznie spokrewnionym szczepem. Stwierdzono, że region ten jest nienaruszony i bardzo podobny (BLASTn, pokrywa 100%, tożsamość 99%, wartość E 0,0) tylko w jednym szczepie (ATCC 33761=DSM 21215) L. oakridgensis-gatunek rzadko powodujący chorobę legionistów.25 wyjaśnilibyśmy niski przypadek śmiertelności obserwowany pod względem wczesnej diagnozy i odpowiedniego i terminowego leczenia, czy unikalne cechy szczepu związanego z wybuchem leżą u podstaw ważnych cech śmiertelności pozostaje w fazie badań.
analiza bliskości źródła oszacowała oczekiwaną liczbę przypadków z populacji rezydentów, co prawdopodobnie doprowadziło do niedoszacowania ekspozycji. Przekonaliśmy się, że informacje o mieszkaniach były gromadzone systematycznie, w przeciwieństwie do historii wysiedleń, również warunki poziomego rozprzestrzeniania aerozoli były bardziej wyraźne w nocy, gdy większość mieszkańców byłaby w swoich domach. Bardziej solidne podejście musiałoby przeprowadzić analizę jako część analizy kontrolnej przypadku, która mogłaby również obejmować ekspozycje u nierezydentów. Chociaż początkowo dyskutowano, nie przeprowadziliśmy badania kontrolnego przypadku z powodu ograniczeń czasowych i zasobów. Bliskość geograficzna wież oznaczała, że niektóre obszary badań pokrywały się, ale mało prawdopodobne, aby blisko położone źródło mogło prowadzić do obecności relacji spadku odległości dla innego źródła. Porównanie rozkładu geoprzestrzennego przypadków z modelowaniem pióropuszowym aerozolu może mieć wartość w celu oceny wpływu ściśle zlokalizowanych źródeł na siebie nawzajem.
to ognisko było drugim co do wielkości ogniskiem choroby legionistów odnotowanym do tej pory i stanowi uzupełnienie dowodów dotyczących wpływu warunków klimatycznych i fenotypów bakterii na ogniska choroby legionistów związane ze wspólnotowymi wieżami chłodniczymi.
konflikty interesów
autorzy nie mają prawa deklarować konfliktów interesów.