introduktion
den 7.November 2014 blev Generaldirektoratet for sundhed i Portugal informeret af et lokalt hospitalslaboratorium med 18 patienter med Legionnaires sygdom, alle indlagt i de foregående 24 timer fra Vila Franca de Lira, by i udkanten af hovedstaden Lissabon. Det blev hurtigt klart, at antallet af sager steg, og der blev identificeret sager fra hele Portugal. En tværfaglig taskforce undersøgte udbruddet, resultaterne af deres indledende undersøgelse førte til lukning af industrielle våde kølesystemer. Under udbrudsundersøgelsen præsenterede vi en rapport, der er offentliggjort som en hurtig meddelelse, der leverer foreløbige data om den epidemiologiske, mikrobiologiske og miljømæssige undersøgelse.1 Denne artikel præsenterer de endelige resultater af udbrudsundersøgelsen.
Legionnaires sygdom, først beskrevet under 1976 Philadelphia American Legion conference2 er en bakteriel pneumonisk infektion med Legionellae arter. De fleste tilfælde tilskrives L. pneumophila SG 1.3 sygdom udvikler sig karakteristisk 2-10 dage efter indånding af aerosoliserede bakterier af modtagelige individer. Risikofaktorer omfatter rygning, ældre personer og personer med kronisk kardiorespiratorisk sygdom.4 vand, enten i naturlige eller kunstige vandmiljøer, er reservoiret for Legionellae arter.5
fra 2008 til 2012 blev der rapporteret mellem 88 og 140 tilfælde årligt i Portugal, hvoraf størstedelen var sporadiske samfundserhvervede tilfælde.6 store samfundsudbrud kan resultere i betydelig sygelighed og dødelighed på kort tid,5 den største til dato blev rapporteret i 2001 i Murcia, Spanien med 449 tilfælde.7
industrielle køletårnssystemer source8 er ofte identificeret som kilden til store samfundsudbrud og er i stand til at sprede forurenede aerosoler over store afstande.9 meteorologiske faktorer, industrielle driftsforhold og utilstrækkelig vedligeholdelse er risikofaktorer for Legionella udbrud forbundet med tårne.8,10
Metoderdefinitioner
et bekræftet tilfælde af legionærsyge havde radiologisk bekræftet lungebetændelse med symptomdebut mellem den 12.oktober, den 02. December 2014, som boede eller arbejdede inden for 10 km fra Vila Franca og havde laboratoriebekræftelse af infektion. Laboratoriekriterierne for et bekræftet tilfælde omfattede isolering af Legionella spp. fra respiratoriske sekretioner, påvisning af L. pneumophila sg1-antigen i urinen, en signifikant stigning i specifikt antistofniveau til L. pneumophila sg 1 i parrede serumprøver. Vi definerede en sandsynlig sag adskiller sig kun i laboratoriet påvisning af enten Legionella spp. nukleinsyre i respiratoriske sekretioner eller et enkelt højt niveau af specifikt antistof mod L. pneumophila sg 1.
identifikation af tilfælde og vurdering af eksponering
tilfælde blev identificeret ved gennemgang af lovpligtige laboratorie-og elektroniske kliniske anmeldelser fra 1.oktober 2014. Personale fra regionale sundhedsmyndigheder undersøgte alle bekræftede og sandsynlige tilfælde, der anvendte et standardspørgeskema for portugisiske legionærsyge, som registrerede demografiske, epidemiologiske og kliniske detaljer. Boligadressen for hver sag blev geokodet i Google Earth.
for at identificere dødsfald krydser vi regelmæssigt udbrudsdatabasen med det portugisiske realtidsinformationssystem for dødscertificering (SICO) fra November 2014 til marts 2015.
kildeidentifikation
mulige kilder til Legionellaforurening, herunder industrier med våde kølesystemer, hospitaler, indkøbscentre og offentlige rekreative faciliteter blev identificeret og som et forholdsregel lukket indtil miljøundersøgelse. Drifts-og vedligeholdelsesrapporter blev kontrolleret, og der blev udtaget prøver for at screene for tilstedeværelsen Legionella spp., resultater førte til identifikation af potentielle kilder. Placeringen af potentielle kilder blev kortlagt ved hjælp af visuel udpegning i Google Earth.
mikrobiologisk, fænotypisk og genotypisk karakterisering
påvisning af L. pneumophila sg 1-antigen blev udført under anvendelse af specifikke urinantigentest i hospitalslaboratorier. Åndedræts-og blodprøver blev behandlet på referencelaboratoriet, National Institute of Health Dr. Ricardo Jorge. Miljøprøver blev opnået under inspektioner udført af Generalinspektoratet for landbrug, hav, miljø og fysisk planlægning i overensstemmelse med portugisiske regler og behandlet af på referencelaboratoriet, National Institute of Health Dr. Ricardo Jorge.
kliniske og miljømæssige prøver blev analyseret ved hjælp af kultur og/eller molekylære teknikker. Kliniske prøver blev dyrket på bcye-baserede medier, og miljøprøver blev dyrket i gvpc selektive medier. Isolater blev identificeret ved hjælp af kommercielle agglutinationssæt (Legionella-Test, Oksoid, Det Forenede Kongerige og Mikrogen-Legionella, Mikrogen-porøse bioprodukter). Kulturresultater for kliniske prøver blev kontrolleret ved hjælp af realtids PCR målrettet mod 16S-og/eller mip-generne (L. pneumophila Real-TM, Sacace Biotechnologies, Italien; Argene Legio pneumo / Cc r-genet, biomasse, Frankrig). Isolater eller kulturnegative / PCR-positive prøver blev karakteriseret ved sekvensbaseret typning (SBT) i overensstemmelse med vejledningen fra Den Europæiske arbejdsgruppe for Legionellainfektioner (EUGLI).11 de syv loci blev udsat for Sanger sekventering ved hjælp af bigdye v1.1 kemi på en 3130hl genetisk analysator (Applied Biosystems). Hele genomsekventering blev udført for 10 kliniske og en miljøprøve på et forkert instrument (Illumina Inc. V2 strømningsceller og 150bp parrede endelæsninger (dækningsdybde >100 gange) for at fastslå deres lighed. Illumina læser blev samlet ved hjælp af fløjl version 1.2.10.12
fænotypisk karakterisering af L. pneumophila sg1 brugte Dresden-panelet af monoklonale antistoffer (Mab ‘er) bestående af seks Mab’ er plus MAb 3 fra Det Internationale Panel opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). En af de mest almindelige metoder til at identificere en person, der er i stand til at identificere en person, der er i stand til at identificere en person, der er i stand til at identificere en person, der er i stand til at identificere en person, der er i stand til at identificere en person, der er i stand til at identificere en person, der er i stand til at identificere en person, der er i stand til at identificere en person, der er i stand til at identificere en person.13 panelet omfattede antistoffer mod MAb 3/1, som betragtes som en virulensmarkør på grund af høj hydrofobicitet af disse stammer.
meteorologiske og luftkvalitetsaspekter
Data blev indhentet fra vejrstationen i Vila Franca og den lokale luftkvalitetsstation (Alverca). Der blev samlet to gange daglige optagelser af temperatur og en gang daglige optagelser af fugtighed, luftkvalitet, vindhastighed og retning for perioden 18.Oktober–1. November 2014.
statistisk analyse
vi gennemførte en kilde nærhedsanalyse af fire potentielle kilder for at teste hypotesen om, at risikoen for sygdom var omvendt relateret til afstanden fra kilden. En buffer på 10 km radius yderligere opdelt i koncentriske 1 km ringe blev placeret på tårnene i hvert industrielt kølesystem. Bufferen og ringene blev derefter opdelt i fire kvadranter, nordøst, sydøst, sydvest og nordvest. Vi sammenlignede antallet af sager med forventede tal. For at beregne forventede tilfælde blev alders-og kønsspecifikke satser for udbruddet anvendt på underafsnittets befolkningstal fra folketællingen i 2011. Underafsnit blev kategoriseret efter afstanden og retningen af deres geografiske centroid fra hver kilde. Det forventede antal tilfælde for hver båndkvadrant blev beregnet som summen af de forventede tilfælde for de underafsnit, hvis centroider lå inden for det. Ved hjælp af Stones ‘ Test (ST) testede vi observerede til forventede forhold for fald i risiko med afstand op til 10 km i nordøst, nordvest, sydøst og Sydvest14 med 9999 Monte Carlo simuleringer og indstil cut-off for statistisk signifikans til 0.05.15
Back beregningsmodeller udviklet af Egan et al.16 blev brugt til at estimere perioden for aerosoliseret frigivelse ved starten af udbruddet. Modellerne blev gentaget ved hjælp af sager anmeldt frem til marts 2015. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af R statistisk programmel.
ResultsOutbreak beskrivelse
den 2.December 2014 blev der identificeret 403 tilfælde af sygdom, hvoraf 377 bekræftede og 26 sandsynlige tilfælde. Fjorten mennesker døde (tilfælde dødsfald 3,5%).
bekræftet tilfælde udviklede symptomer mellem 14.oktober og 2. December 2014. Antallet af sager toppede den 6. November, og udbruddet blev erklæret den 7.November (Fig. 1).
bekræftede tilfælde af legionærsyge efter dato for symptomdebut, Vila Franca, Portugal, 14. oktober-2. December 2014 (n=377).
de højeste angrebsfrekvenser blev set i sognet P Kurtvoa de Santa Iria/Forte De Casa (60 pr.10.000 indbyggere) og faldt med stigende afstand fra dette sogn (Fig. 2).
kort, der viser angrebsfrekvensen for legionærsyge efter bopæl (Sogn), Vila Franca, Portugal.
der var 252 bekræftede tilfælde hos mænd (66%). Medianalderen var 59 år, angrebsfrekvensen var højere hos mænd og steg med alderen hos begge køn (25,1 pr.10.000 mænd i alderen 20-64 år mod 37,9 pr. 10.000 mænd over 65 år) og kvinder (9,0 pr. 10.000 kvinder i alderen 20-64 år mod 26,1 tilfælde pr. 10.000 kvinder over 65 år).
to hundrede og otte (55%) bekræftede tilfælde rapporterede også øget sygdomsfølsomhed oftest på grund af rygning og kronisk hjerte-respiratorisk sygdom.
kildeidentifikation
niogfyrre mulige kilder; indenlandske, offentlige, kommercielle og industrielle (5) blev identificeret og reduceret til fire potentielle kilder efter miljøundersøgelse. Alle fire var industrier med våde kølesystemer.
tre ud af de fire potentielle kilder rapporterede mistænkte tilfælde blandt ansatte, ni tilfælde blev bekræftet.
mikrobiologisk og fænotypisk analyse og genetisk karakterisering
referencelaboratoriet modtog 95 miljøprøver fra 49 mulige kilder, hvoraf L. pneumophila positive kulturer blev isoleret i 8. Disse prøver stammer fra fire industrier med våde kølesystemer og et forretningslokale. Seks af de 8 positive kulturer var L. pneumophila sg 2-15 (75%). L. pneumophila sg 1 blev isoleret fra to miljøprøver taget fra det samme tårn i et industrielt system, registrerede koncentrationer var 1,42 liter 106ufc/l den 8.November og 421ufc/l den 10. November. Sekvensbaseret typning af disse to miljøisolater identificerede den nye genotype ST1905.
laboratoriebekræftelse af tilfælde blev udført af; urinantigen test for L. pneumophila sg 1 (92%); serokonversion (2%); PCR (3%) og unik titer til L. pneumophila (3%). 152 kliniske prøver blev sendt til referencelaboratoriet. Af disse afslørede 71 tilstedeværelsen af L. pneumophila sg 1 med identisk ST1905 SBT-profil.
37 isolater af L. pneumophila sg 1 gennemgik fænotypisk karakterisering, 35 isolater fra kliniske prøver og to fra miljøprøver. Alle 37 isolater præsenterede den samme fænotypiske egenskab; subtype Frankrig/Allentro og besad den virulensassocierede epitop anerkendt af monoklonalt antistof MAb 3/1 (Fig. 3).
Mikrobiolologisk behandling og resultater af kliniske prøver.
for at bekræfte den genetiske sammenhæng mellem st1905-isolater blev 10 ud af de 71 kliniske isolater og et miljømæssigt positivt isolat opnået fra det industrielle køletårn nominelt valgt til helgenomsekventering. Vi var i stand til at bruge omkring 99.8% af hver træksekvens og fandt ingen nukleotidforskelle inden for de sammenlignede 3,47 Mb af genomet. Fylogenetisk analyse, der involverede flere L. pneumophila-isolater fra hele verden, afslørede, at st1905-klyngen klart divergerede fra grenen, der tilmeldte de mest studerede L. pneumophila-stammer (serogrupper 1, 6 og 12)17-19 og var tættere beslægtet med L. pneumophila subsp. fraseri-stammer (serogruppe 4, 5 og 15).20 uger bekræftelse af st1905 allelprofil fremhævede en bias forbundet med in silico ekstraktion af allelsekvensen for mompS locus. Den undersøgte stamme viste ikke-matchende momps-kopier, hvilket hæmmede en ordentlig St-tilskrivning, hvis SBT udelukkende blev bestemt i silico (Fig. 4).
fylogenetisk træ, der sammenligner hele genomsekvensen af miljømæssige og kliniske isolater.
meteorologiske, klima–og luftkvalitetsresultater
temperaturer, der overstiger det månedlige gennemsnit, blev registreret fra 18.oktober til 1. November (>20 liter C) med en vedvarende natlig termisk inversion forbundet med en dominerende ne-og NNE-vind med 2-3 km/t hastighed. Den sidste uge i oktober havde mere end 80% relativ luftfugtighed, med perioder på over 90%. Oktober 2014 var den varmeste Oktober på det portugisiske fastland siden 1931, inklusive en 11 dages varmebølge i perioden 17-27 oktober. Fra 19.oktober til 1. November blev tre gange det anbefalede niveau af partikler (PM10) og de højeste ugentlige værdier i 2014 registreret i den lokale luftkvalitetsstation, tilskrevet en stærk episode af Sahara-støv transporteret til det portugisiske fastland.
eksponeringsperiode
de bedst tilpassede backberegningsmodeller foreslog en logistisk vækst i miljøeksponeringen med størst intensitet mellem 16.oktober og 4. November (Fig. 1).
kilde nærhedsanalyseresultater
når kilden nærhedsanalyse blev udført, var der 365 bekræftede tilfælde, hvoraf 328 (90%) blev geo-refereret til inden for 10 km af en af de fire potentielle kilder (Fig. 5).
legionærers sygdom nær fire industrier med våde kølesystemer efter bopælsafstand fra tårnet(e).
alle fire potentielle kilder viste et signifikant fald i sygdomsrisiko med stigende afstand (klyngedannelse) i SV-Kvadranten. Den højeste klyngedannelse (ST157, p
0,001) blev observeret i SV-kvadranten i industri 1. Klyngedannelse blev også observeret med industri 2 (ST 117, p0.001), industri 3 (ST 126, p0.001) og industri 4 (ST 66.1, p0.001). Risikoen for sygdom faldt konsekvent med stigende afstand fra kilden uden tegn på toppe eller trug i denne kvadrant. Der blev ikke observeret nogen klyngedannelse i se-kvadranterne i nogen industri, et område, der stort set bestod af floden. Industri 1 og 2 viste en lavere grad af klyngedannelse i NE-kvadranten (henholdsvis ST 5, p=0,01 og ST 4,2, p=0,01). Klyngedannelse blev også demonstreret i NV-kvadranten i industri 1 (ST 3.9, p=0.01).Diskussion
vi identificerede fire industrier med vådt kølesystem som de mest sandsynlige kilder til det næststørste udbrud af legionærers sygdom registreret med 403 tilfælde og 14 dødsfald. Forhøjede koncentrationer af L. pneumophila sg 1 ST1905, der demonstrerer den virulente MAB 3-1-undergruppe, blev identificeret i tårnene i en industri. Ved hjælp af SBT og VGS, vi var i stand til at bekræfte den genetiske sammenhæng mellem de udbrudsassocierede kliniske og miljømæssige stammer. De eneste positive isolater til L. pneumophila sg 1 blev begge opnået fra køletårnet i en industri. Lignende koncentrationer af L. pneumophila er blevet isoleret i andre køletårne forbundet med udbrud.5 Det er sandsynligt, skønt det ikke er bevist, at krydskontaminering af de fire tæt beliggende tårne bidrog til omfanget af udbruddet og tidligere er blevet beskrevet.21
de usædvanligt varme temperaturer, der blev registreret i Oktober 2014, understøttede spredning af Legionellaarter i køletårnssystemer.22 de høje PM10-koncentrationer kunne have fungeret som skykoncentrationskerner, der letter aerosoldannelse. Fordelingen og det store antal tilfælde skyldes NE-vinden, den høje relative fugtighed og den termiske inversion, der blev observeret i den estimerede frigivelsesperiode ud over levetiden 23 og øget virulens24 af en bakterie med epitope MAb3/1.
udbruddet fandt sted i et tætbefolket område tæt på hovedstaden Portugal, der indeholder stærkt anvendte pendlerruter fra forstæder. Det faktiske antal udsatte personer var sandsynligvis meget højere end den bosiddende befolkning. Standarddiagnostiske tests registrerer muligvis ikke alle tilfælde.3 de fremlagte tal indeholder ikke tilfælde af Pontiac-feber eller mistænkte tilfælde, der testede negativt og derfor sandsynligvis undervurderer den sygelighed, som samfundet oplever, og indvirkningen på lokale sundhedsydelser. I modsætning til tilstedeværelsen af elektronisk dødsmeddelelse i Portugal var det muligt at sikre, at oplysninger om, hvorvidt en sag var død, var fuldstændige. Den observerede dødsfald (3,5% af alle tilfælde) var lavere end de 6%, der normalt blev observeret i udbrud forbundet med køletårne og systemer.8 udbruddet forårsagende stamme fylogenetisk grupperet bortset fra de mest undersøgte udbrudsassocierede L. pneumophila sg 1 stammer (Lp Philadelphia-1, LP Paris, Lp Lens, Lp Corbyog Lp 2300/99 Alcoy). Det viste sig at være tæt beslægtet med L. pneumophila subsp. fraseri stammer fra andre serogrupper end sg 1. Den undersøgte stamme har en eksklusiv genomisk region på 38 Kb sammenlignet med den næstmest fylogenetisk relaterede stamme. Denne region viste sig at være intakt og meget ens (BLASTn, dække 100%, identitet 99%, E-værdi 0,0) kun i en stamme (ATCC 33761=DSM 21215) af L. oakridgensis, en art, der sjældent forårsager legionærers sygdom.25 vi ville forklare den lave tilfælde dødsfald observeret med hensyn til tidlig diagnose og passende og rettidig behandling, om de unikke træk ved den udbrudsassocierede stamme ligger til grund for vigtige egenskaber ved dødelighed forbliver under undersøgelse.
kildenærhedsanalysen estimerede det forventede antal tilfælde fra beboerpopulationen, hvilket sandsynligvis førte til en undervurdering af eksponeringen. Vi begrundede, at boligoplysninger blev indsamlet systematisk, i modsætning til forskydningshistorie, også betingelser for vandret udbredelse af aerosoler var mere udtalt om natten, når de fleste beboere ville have været i deres hjem. En mere robust tilgang ville skulle udføre analysen som led i en case control-undersøgelse, som også kunne omfatte eksponeringer hos ikke-residenter. Selvom vi oprindeligt diskuterede, fortsatte vi ikke med en case–control-undersøgelse på grund af ressource-og tidsbegrænsninger. Tårnernes tætte geografiske nærhed betød, at der var overlapning af nogle af undersøgelsesområderne, hvilket gjorde det muligt, men usandsynligt, at en tæt placeret kilde kunne føre til tilstedeværelse af et afstandsnedgangsforhold for en anden kilde. Sammenligning af den geospatiale fordeling af sager med plume modellering af aerosol kunne være af værdi for at vurdere virkningen af tæt beliggende kilder på hinanden.
dette udbrud var det næststørste udbrud af legionærsyge, der er registreret til dato, og tilføjer bevis for virkningen af klimatiske forhold og bakterielle fænotyper i køletårnsassocierede samfundsudbrud af legionærsyge.
interessekonflikter
forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.