はじめに
2014年11月7日、ポルトガル保健総局は、首都リスボン郊外のヴィラ・フランカ・デ・シラの24時間前に入院したレジオネラ症患者18人の地元病院の検査室から報告を受けました。 それは急速にケースの数が上昇していたことが明らかになり、ケースはポルトガル全土から識別されました。 学際的なタスクフォースが流行を調査し、予備調査の結果は工業用湿式冷却システムの閉鎖につながった。 アウトブレイク調査では、疫学的、微生物学的および環境調査の予備データを提供し、迅速なコミュニケーションとして公開された報告書を発表しました。1この記事では、アウトブレイク調査の最終結果を紹介します。
レジオネラ症は、1976年のPhiladelphia American Legion conference2で初めて報告されたレジオネラ属菌による細菌性肺炎である。 L.pneumophila sg1.3疾患に起因するほとんどの症例は、感受性の高い個体によるエアロゾル化細菌の吸入後2-10日後に特徴的に発症する。 危険因子には、喫煙、高齢者および慢性心臓呼吸器疾患を有する者が含まれる。4水は、自然または人工の水生環境のいずれかで、レジオネラ種のための貯水池です。5
2008年から2012年にかけて、ポルトガルでは毎年88件から140件の症例が報告されており、その大部分は散発的なコミュニティ獲得症例であった。6大規模なコミュニティの発生は、時間の短いスペースで有意な罹患率と死亡率をもたらすことができ、5これまでに最大のものは、449例とムルシア、スペイ7
大規模なコミュニティの発生源として頻繁に特定されている工業用冷却塔システムsource8は、汚染されたエアロゾルを長距離にわたって拡散させることができます。9気象要因、産業運転条件および不十分な維持はタワーと関連付けられるLegionellaの発生のための危険率である。8,10
MethodsDefinitions
レジオネラ症の確認された症例は、12月02日から2014年の間に発症した肺炎を放射線学的に確認し、ビラ-フランカ-デ-シラの10km以内に住んでいたか、または勤務しており、感染の検査室で確認していた。 確認された症例の実験室基準には、Legionella sppの単離が含まれていた。 呼吸分泌物から、Lの検出。 尿中のpneumophila sg1抗原、対になった血清サンプルにおけるL.pneumophila sg1に対する特異的抗体レベルの有意な上昇。 いずれかのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａｓｐｐの実験室検出においてのみ異なる可能性のある症例を定義した。 呼吸分泌物中の核酸またはL.pneumophila sgに対する単一の高レベルの特異的抗体1。
症例の同定および曝露の評価
症例は、1October2014から法定検査室および電子臨床通知を見直すことによって同定された。 地域保健当局のスタッフは、人口統計学的、疫学的および臨床的詳細を記録した標準的なポルトガルのレジオネラ病アンケートを適用して、確認されたすべての症例および可能性のある症例にインタビューした。 それぞれのケースの居住地の住所はGoogle Earthでジオコーディングされました。
死亡を特定するために、2014年11月から2015年3月まで、流行データベースをポルトガルの死亡認定リアルタイム情報システム（SICO）と定期的に照合しました。
発生源の特定
湿式冷却システムを備えた産業、病院、モール、公共レクリエーション施設を含むレジオネラ汚染の可能性のある発生源が特定され、予防措置として環境調査まで閉鎖された。 運用および保守報告書をチェックし、サンプルをスクリーニングしてLegionella sppの存在を確認しました。、結果は、潜在的なソースの同定につながった。 潜在的なソースの位置は、Google Earthの視覚的なピンポイントを使用してマッピングされました。
微生物学的、表現型および遺伝子型の特性評価
L.pneumophila sg1抗原の検出は、病院の実験室で特定の尿抗原検査を用いて行われました。 呼吸器および血液標本は、国立衛生研究所のRicardo Jorge博士の基準研究所で処理されました。 環境サンプルはポルトガルの規則に従って農業、海、環境および空間計画のための一般的な検査官によって遂行される点検の間に得られ、参照の実験室で、健康博士Ricardo Jorgeの国民の協会によって処理された。
臨床および環境サンプルは、培養および/または分子技術を用いて分析した。 臨床標本はＢＣＹＥベースの培地で培養し，環境試料はＧＶＰＣ選択培地で培養した。 単離株は、市販のラテックス−凝集キット（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｌａｔｅｘ Ｔｅｓｔ，Ｏｘｏｉｄ，Ｕｎｉｔｅｄ ＫｉｎｇｄｏｍおよびＭｉｃｒｏｇｅｎ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ，Ｍｉｃｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）によって同定した。 Ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ Ｒｅａｌ−ＴＭ，Ｓａｃａｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｔａｌｙ；Ａｒｇｅｎｅ Ｌｅｇｉｏ ｐｎｅｕｍｏ／Ｃｃ ｒ−ｇｅｎｅ，Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を標的としたリアルタイムＰＣＲにより、臨床試料の培養結果をチェックした。 分離株、または培養陰性/PCR陽性の標本は、レジオネラ感染症（EWGLI）のための欧州ワーキンググループの指導に従って、配列ベースのタイピング（SBT）によって特徴付けら１ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを３ １ ３ ０ＸＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で使用することにより、７つの遺伝子座をサンガー配列決定に供した。 全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）を、Ｍｉｓｅｑ装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を使用して、それらの類似性を確認するために、Ｍｉｓｅｑ ｖ２フローセルおよび１ ５ ０ｂｐ対端読み取り（ｄｅｐｔｈ ｏ ｆ ｃｏｖｅｒａｇｅ＜７ ６ ８ ３＞１ ０ ０−ｆｏｌｄ）を使用する。 イルミナの読み取りは、Velvetバージョン1.2.10.12
Lの表現型特性評価を使用して組み立てられました。 ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ｓｇ１は、６つのＭａｂと、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣ Ｃ）から入手した国際パネルのＭａｂ３とからなるｄｒｅｓｄｅｎ ｐａｎｅｌ ｏ ｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍａｂ）を使用した。 解析は、ノックスビル、フィラデルフィア、フランス/アレンタウン、ベニドーム、オルダ、オックスフォード、ヘイシャム、キャンパーダウン、ベリンガムの九つのサブグループの一つにL.pneumophilaを特徴付けることができるewgliによって承認された確立されたアルゴリズムに従った。パネルには、これらの株の高い疎水性に起因する病原性マーカーと考えられるＭａｂ３／１に対する抗体が含まれていた。
気象および大気質の側面
データは、Vila Franca de Xiraの気象観測所および地元の大気質観測所（Alverca）から得られた。 2014年10月18日から11月1日までの間、1日2回の温度記録と1日1回の湿度、空気の質、風速および方向の記録が収集されました。
統計分析
4つの潜在的な情報源の情報源近接分析を実施し、病気のリスクが情報源からの距離に反比例するという仮説を検証しました。 QGISソフトウェアを使用して、半径10kmのバッファをさらに同心円状の1kmリングに細分し、各工業用冷却システムの塔に配置しました。 バッファとリングは、その後、北東、南東、南西、北西の四つの象限に分割されました。 症例数と予想数を比較した。 予想される症例を計算するために、2011年の国勢調査からのサブセクション人口数に発生の年齢および性別固有の割合が適用されました。 サブセクションは、各ソースからの地理的重心の距離と方向に従って分類されました。 各バンド象限の予想されるケース数は、重心がその中にあるサブセクションの予想されるケースの合計として計算されました。 ストーンズ検定（ST）を用いて、北東、北西、南東、南西10kmまでの距離14を9999モンテカルロシミュレーションでテストし、統計的有意性のカットオフを0.05.15
Eganらによって開発された逆計算モデルを設定した。発生の開始時のエアロゾル放出の期間を推定するために、図１ ６を使用した。 モデルは2015年までに通知されたケースを使用して繰り返されました。 統計解析は、Ｒ統計ソフトウェアを使用して行った。
ResultsOutbreak description
2December2014までに、403例の疾患が同定され、そのうち377例が確認され、26例が確認されました。 十四人が死亡した（ケース死亡率3.5％）。
確認された症例は、14Octoberと2December2014の間に症状を発症した。 症例数は6月にピークを迎え、7月に流行が宣言された（図。 1).
レジオネラ症の症状発症日別に確認された症例,Vila Franca de Xira,Portugal,14October–2December2014(n=377).
最も高い攻撃率は、Póvoa de Santa Iria/Forte de Casaの教区（人口10,000人あたり60）で見られ、この教区からの距離の増加に伴って低下しました（図1）。 2).
ポルトガル、Vila Franca de Xiraの居住地（教区）別のレジオネラ病の攻撃率を示す地図。
男性には252例が確認された（66％）。 中央値年齢は59歳であり、攻撃率は男性で高く、男女とも年齢とともに増加した（25.1歳あたり10,000人20-64歳に対して37.9歳あたり10,000人65歳）と女性（9.0歳あたり10,000人20-64歳に対して26.1歳あたり10,000人65歳）。
二百八（55％）確認された症例はまた、喫煙および慢性心臓呼吸器疾患による最も一般的な疾患感受性の増加を報告した。
ソースの識別
四十九の可能なソース;国内、公共、商業および産業(5)は、環境調査の後に特定され、四つの潜在的なソースに減少しました。 いずれも湿式冷却システムを備えた産業であった。
従業員の疑いがあると報告された4つの潜在的な情報源のうち3つ、9つのケースが確認されました。
微生物学的および表現型分析および遺伝的特性評価
参考研究室では、95の可能な源から49の環境サンプルを受け取り、そのうちL.pneumophila陽性培養物は8で単離された。 これらのサンプルは、湿式冷却システムと一つの商業施設を持つ四つの産業から発生しました。 8陽性の培養物の六つは、L.pneumophila sg2-15(75%)でした。 L.pneumophila sg1は、一つの産業システムの同じタワーから採取された二つの環境サンプルから単離され、記録された濃度は1.42×106ufc/l8月と421ufc/l10月であった。 これら二つの環境分離株のシーケンスベースのタイピングは、新規遺伝子型ST1905を同定した。
は、l.pneumophila sg1の尿中抗原検査（92％）によって症例の検査室確認が行われた。; 血清変換（２％）；ＰＣＲ（３％）およびｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａに対するユニークな力価（３％）。 152の臨床標本を参照実験室に送付した。 これらのうち、71は、同一のST1905SBTプロファイルを持つL.pneumophila sg1の存在を明らかにした。
L.pneumophila sg1の37分離株は、臨床サンプルから35分離株と環境サンプルから二つの表現型の特性評価を受けました。 サブタイプFrance/Allentownとモノクローナル抗体MAb3/1によって認識される病原性関連エピトープを持っていた（図。 3).
微生物学的処理と臨床標本の結果。
ST1905分離株の遺伝的関連性を確認するために、10のうち71臨床分離株と工業用冷却塔から得られた一つの環境陽性分離株は、名目上、全ゲノムシーケンス 私たちは約99を使用することができました。各ドラフト配列の8％とゲノムの比較3.47Mb内のヌクレオチドの違いを発見しませんでした。 世界中から複数のl.pneumophila分離株を含む系統発生分析は、ST1905クラスターは明らかに最も研究されたL.pneumophila株（血清群1、6および12）17-19を登録する枝から分岐し、より密接にL.pneumophila subspと関連していたことを明らかにした。 fraseri株（血清群4、5および15）。20WGS ST1905対立遺伝子プロファイルの確認は、mompS遺伝子座の対立遺伝子配列のin silico抽出に関連するバイアスを強調した。 研究された株は、SBTが排他的にsilicoで決定された場合、適切なST帰属を妨げた非マッチングmompSコピーを表示した（図。 4).
環境分離株と臨床分離株の全ゲノム配列を比較する系統樹。
気象、気候、大気質の結果
月平均を超える気温が18日から11月（>20℃）に記録され、2–3km/hの速度で優勢なNEおよびNNE風に関連する夜間の熱反転が持続した。 月の最後の週は80％以上の相対湿度を持っていた、期間は90％を超えていました。 2014年10月は、10月17日から27日の間の11日間の熱波を含む、1931年以来、ポルトガル本土で最も暖かい10月でした。 10月19日から11月1日にかけて、ポルトガル本土に輸送されたサハラ砂漠の塵の強いエピソードに起因する、地元の大気質局では、粒子状物質の推奨レベル（PM10）と2014年の最高週値の3倍が記録された。
暴露評価期間
最良のフィッティング逆計算モデルは、環境暴露のロジスティック成長を示唆し、10月16日から11月4日の間に最大の強度を示した（図。 1).
ソース近接解析結果
ソース近接解析を行ったところ、365件の確認例があり、そのうち328件（90%）が潜在的なソースのいずれかの10km以内に地理参照されていた（図。 5).
タワーからの居住距離による湿式冷却システムを有する四産業付近のレジオネラ病。
すべての四つの潜在的なソースは、SW象限の距離（クラスタリング）の増加に伴って疾患リスクの有意な低下を示した。 最も高いクラスタリング（ST157、p
0.001）は、業界1のSW象限で観察されました。 クラスタリングは、産業2（ST117、p0.001）、産業3（ST126、p0.001）および産業4（ST66.1、p0.001）でも観察された。 病気のリスクは、この象限にピークまたは谷の証拠なしでソースからの距離の増加と一貫して減少しました。 主に川で構成される地域である産業のSE象限では、クラスタリングは観察されなかった。 業界1と2は、NE象限でクラスタリングの程度が低いことを示しました（それぞれST5、p=0.01およびST4.2、p=0.01）。 クラスタリングは、業界1のNW象限（ST3.9、p=0.01）でも実証されました。ディスカッション
我々は、403例と14人の死亡で記録されたレジオネラ病の二番目に大きい流行の最も可能性の高い原因として、湿式冷却システムを Lの濃度が上昇した。 pneumophila sg1ST1905は、病原性MAb3-1サブグループを示す一つの産業の塔で同定された。 SBTとWGSを用いて、我々はアウトブレイク関連の臨床および環境株の遺伝的関連性を確認することができました。 L.pneumophila sg1の唯一の陽性分離株は、いずれも一つの産業の冷却塔から得られた。 同様の濃度のl.pneumophilaが、流行に関連する他の冷却塔で単離されている。5密接に配置された四つの塔の交差汚染が発生の大きさに寄与していることは証明されていないが、可能性があり、以前に説明されている。21
2014年10月に記録された季節外れの暖かい気温は、冷却塔システムにおけるレジオネラ種の増殖を支持した。22高いPM10濃度は、エアロゾル形成を促進する雲濃度核として作用している可能性がある。 分布と多数の症例は、エピトープMab3/1を有する細菌の長寿23と高められたウイルス性24に加えて、推定放出期間中に観察されたNE風、高い相対湿度および熱反転によって説明される。
郊外からの通勤ルートが多く利用されているポルトガルの首都に近い人口密度の高い地域で発生しました。 実際に暴露された人々の数は、居住者の人口よりもはるかに高かった可能性が高い。 標準的な診断テストでは、すべての症例が検出されない場合があります。3提示された数値には、ポンティアック熱の症例または陰性であった疑いのある症例が含まれていないため、地域社会が経験する罹患率および地元の保健サービスへの影響を過小評価している可能性がある。 これとは対照的に、ポルトガルでは電子的な死亡通知が存在するため、事件が死亡したかどうかに関する情報が完全であることを保証することが 観察された症例の死亡率（すべての症例の3.5％）は、冷却塔およびシステムに関連する発生で通常観察された6％よりも低かった。8最も研究されている流行に関連するl.pneumophila sg1株（Lp Philadelphia-1、Lp Paris、Lp Lens、Lp Corby、およびLp2300/99Alcoy）から離れて系統発生的にクラスター化された流行原因株。 Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａｓｕｂｓｐと密接に関連していることが分かった。 sg1以外の血清群からのfraseri株。 研究された株は、次の最も系統発生的に関連する株と比較して排他的な≥38kbのゲノム領域を保有しています。 この領域は、Ｌの１株（ＡＴＣＣ３ ３ ７ ６ １＝ＤＳＭ２ １ ２ １ ５）においてのみ無傷であり、非常に類似していることが見出された（Ｂｌａｓｔｎ、カバー１ ０ ０％、同一性９ ９％、Ｅ値０． オクリドゲンシス（oakridgensis）は、レジオネラ症を引き起こすことはほとんどない種である。25我々は、致死性の重要な特性の根底にある流行関連株のユニークな特性が研究中のままであるかどうか、早期診断と適切かつタイムリーな治療の面で観察された低症例死亡率を説明する。
ソース近接分析は、居住者集団からの予想される症例数を推定し、暴露の過小評価につながった可能性が高い。 我々は、住宅情報が体系的に収集されたことを推論しました,変位履歴とは異なり、,また、エアロゾルの水平伝播のための条件は、ほとんどの住民が自分の家にいたであろう夜の時間に、より顕著でした. より堅牢なアプローチは、ケースコントロール研究の一環として分析を実行する必要があり、これには非居住者の曝露も含まれる可能性があります。 当初は議論されていましたが、リソースと時間の制約のためにケースコントロール研究を進めませんでした。 塔が地理的に近接していることは、いくつかの研究領域が重複していることを意味していましたが、密接に位置するソースが別のソースの距離減少関係の存在につながる可能性は低いと考えられていました。 ケースの地理空間分布とエアロゾルのプルームモデリングを比較することは、密接に位置するソースが互いに影響を評価するための価値があります。
この大流行は、これまでに記録されたレジオネラ病の二番目に大きな大流行であり、レジオネラ病のコミュニティの大流行に関連する冷却塔におけ
利益相反
著者には、宣言する利益相反はありません。