Introdução
Em 7 de novembro de 2014, a Direcção-Geral da Saúde em Portugal, foi informado por um hospital local laboratório de 18 pacientes com a doença dos Legionários, todos os admitidos no anterior 24h de Vila Franca de Xira, cidade nos arredores da capital da cidade de Lisboa. Tornou-se rapidamente evidente que o número de casos estava a aumentar e foram identificados casos de todo o território português. Uma taskforce multidisciplinar investigou o surto, os resultados de sua investigação preliminar levaram ao fechamento de sistemas industriais de refrigeração por via húmida. Durante a investigação do surto, apresentámos um relatório que foi publicado como uma comunicação rápida, fornecendo dados preliminares da investigação epidemiológica, microbiológica e ambiental.1 este artigo apresenta os resultados finais da investigação do surto.A doença de Legionnaires, descrita pela primeira vez em 1976 pela Philadelphia American Legion conference2, é uma infecção bacteriana pneumónica com espécies de Legionelae. A maioria dos casos atribuídos à doença de L. pneumophila sg 1.3 caracteriza-se por desenvolver 2 a 10 dias após a inalação de bactérias aerossolizadas por indivíduos susceptíveis. Os factores de risco incluem o tabagismo, os indivíduos mais velhos e aqueles com doença cardiorrespiratória crónica.4 água, em ambientes aquáticos naturais ou artificiais, é o reservatório para espécies de Legionelas.5
de 2008 a 2012, entre 88 e 140 casos foram relatados anualmente em Portugal, dos quais a maioria eram casos de comunidade esporádica adquirida.6 grandes surtos comunitários podem resultar em morbilidade e mortalidade significativas num curto espaço de tempo,5 o maior até à data foi reportado em 2001 em Múrcia, Espanha, com 449 casos.7
frequentemente identificado como a fonte de grandes surtos comunitários, os sistemas de refrigeração industrial source8 são capazes de disseminar aerossóis contaminados a grandes distâncias.9 factores meteorológicos, condições operacionais industriais e manutenção inadequada são factores de risco para surtos de Legionelas associados a Torres.8,10
definições de métodos
um caso confirmado de doença de legionários teve pneumonia radiologicamente confirmada com início dos sintomas entre 12 de outubro e 02 de dezembro de 2014, que viveu ou trabalhou a 10 km de Vila Franca de Xira e teve confirmação laboratorial de infecção. Os critérios laboratoriais para um caso confirmado incluíam o isolamento de Legionella spp. a partir de secreções respiratórias, a detecção de L. antigénio de pneumophila sg1 na urina, um aumento significativo do nível de anticorpos específicos para L. pneumophila sg 1 em amostras de soro emparelhadas. Definimos um caso provável diferido apenas na detecção laboratorial de qualquer Legionella spp. ácido nucleico em secreções respiratórias ou um único nível elevado de anticorpos específicos de L. pneumophila sg 1.A identificação dos casos e a avaliação da exposição
foram identificadas através da revisão das notificações laboratoriais Obrigatórias e clínicas eletrónicas a partir de 1 de outubro de 2014. O pessoal das autoridades regionais de saúde entrevistou todos os casos confirmados e prováveis de aplicação de um questionário normalizado para a doença dos Legionários portugueses, que registava dados demográficos, epidemiológicos e clínicos. O endereço residencial de cada caso foi geocodificado no Google Earth.
para identificar as mortes, cruzamos regularmente a base de dados de surtos com o sistema Português de informação em tempo real para a certificação de óbitos( SICO), de novembro de 2014 a março de 2015.
identificação da fonte
possíveis fontes de contaminação por Legionelas, incluindo indústrias com sistemas de refrigeração por via húmida, hospitais, centros comerciais e instalações recreativas públicas foram identificadas e, como medida de precaução, encerradas até investigação ambiental. Foram verificados os relatórios operacionais e de manutenção, tendo sido colhidas amostras para detectar a presença de Legionella spp., os resultados levaram à identificação de potenciais fontes. As localizações de fontes potenciais foram mapeadas usando localização visual no Google Earth.
caracterização microbiológica, fenotípica e genotípica
a detecção do antigénio l. pneumophila sg 1 foi realizada utilizando testes específicos de antigénios urinários em laboratórios hospitalares. Amostras respiratórias e de sangue foram processadas no laboratório de referência, O Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. Amostras ambientais foram obtidos durante as inspeções realizadas pela Inspecção-Geral da Agricultura, do Mar, do Ambiente e do ordenamento do território, em conformidade com as normas portuguesas e processada no laboratório de referência, o Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge.Foram analisadas amostras clínicas e ambientais utilizando técnicas de cultura e/ou moleculares . As amostras clínicas foram cultivadas em meios baseados em BCYE e amostras ambientais foram cultivadas em meios seletivos GVPC. Os isolados foram identificados por kits comerciais de aglutinação em látex (teste Legionella latex, Oxoid, Reino Unido e Microgen Legionella, microgen® Bioproducts,). Os resultados da cultura para amostras clínicas foram verificados por PCR em tempo real, direcionados para os genes 16S e/ou mip (l. pneumophila Real-TM, Sacace Biotechnologies, Itália; Argene Legio pneumo/Cc R-gene, bioMérieux, França). Os isolados, ou amostras culturas negativas/PCR positivas, foram caracterizados por tipagem sequencial (SBT) de acordo com as orientações do grupo de trabalho europeu para as infecções por Legionelas (EWGLI).Os sete loci foram submetidos à sequenciação de Sanger usando a química BigDye v1.1 em um analisador genético 3130XL (Biosystems aplicados). A sequenciação do genoma completo (WGS) foi realizada para 10 amostras clínicas e uma ambiental em um instrumento MiSeq (Illumina Inc., San Diego, USA) usando células de fluxo MiSeq V2 e leituras de 150bp emparelhadas (profundidade de cobertura > 100 vezes) para verificar a sua semelhança. As leituras de Illumina foram montadas usando a versão de veludo 1.2.10.12
caracterização fenotípica de L. pneumophila sg1 utilizou o painel de anticorpos monoclonais de Dresden (MAbs) constituído por seis MAbs mais o MAb 3 do Painel Internacional obtido da American Type Culture Collection (ATCC). Analysis followed an established algorithm, endossed by EWGLI which can characterize L. pneumophila into one of nine subgroups; Knoxville, Philadelphia, France/Allentown, Benidorm, OLDA, Oxford, Heysham, Camperdown and Bellingham.O painel incluiu anticorpos ao MAb 3/1 que é considerado um marcador de virulência devido à elevada hidrofobicidade destas estirpes.
aspectos meteorológicos e de qualidade do ar
foram obtidos dados da Estação meteorológica de Vila Franca de Xira e da estação local de qualidade do ar (Alverca). Gravações duas vezes por dia de temperatura e uma vez por dia de umidade, qualidade do ar, velocidade do vento e direção foram coletadas para o período de 18 de Outubro–1 de novembro de 2014.
análise estatística
realizamos uma análise de proximidade da fonte de quatro fontes potenciais para testar a hipótese de que o risco de doença estava inversamente relacionado com a distância da fonte. Usando o software QGIS, um buffer de 10km de raio ainda subdividido em anéis concêntricos de 1km foi colocado nas torres de cada sistema de refrigeração industrial. O buffer e os anéis foram então divididos em quatro quadrantes, Nordeste, Sudeste, Sudoeste e Noroeste. Comparamos o número de casos com os números esperados. Para calcular os casos esperados, as taxas específicas de idade e sexo para o surto foram aplicadas para a subsecção contagem da população a partir do censo de 2011. Subseções foram categorizadas de acordo com a distância e direção de seu centroide geográfico a partir de cada fonte. O número esperado de casos para cada quadrante de banda foi calculado como a soma dos casos esperados para as subseções cujos centroids estão dentro dele. Utilizando Pedras de Teste (ST), testamos observado esperado razões para o declínio no risco, com distância de até 10km a Norte, Leste, Norte, Oeste, Sul, Leste e Sul West14 com 9999 simulações de Monte Carlo e definir o ponto de corte para significância estatística em 0.05.15
cálculo de retorno modelos desenvolvidos por Egan et al.16 foram utilizados para estimar o período de libertação de aerossóis no início do surto. Os modelos foram repetidos utilizando casos notificados até Março de 2015. A análise estatística foi realizada utilizando software estatístico R.
ResultsOutbreak description
By 2 December 2014, 403 cases of disease were identified of which 377 confirmed and 26 probable cases. Catorze pessoas morreram (taxa de mortalidade de 3,5%).Casos confirmados desenvolveram sintomas entre 14 de outubro e 2 de dezembro de 2014. O número de casos atingiu um pico em 6 de novembro e o surto foi declarado em 7 de novembro (Fig. 1).
casos confirmados de doença dos Legionários por data de início dos sintomas, Vila Franca de Xira, Portugal, 14 de outubro–2 de dezembro de 2014 (n=377).
as taxas de ataque mais elevadas foram observadas na freguesia da Póvoa de Santa Iria/Forte de Casa (60 por 10 000 habitantes) e desceram com uma distância crescente desta freguesia (Fig. 2).
houve 252 casos confirmados em homens (66%). A mediana de idade foi de 59 anos, a taxa de ataque foi maior em homens e aumenta com a idade em ambos os sexos (de 25,1 por 10.000 homens com idade entre 20 e 64 anos anos versus crescimento de 37,9 por 10.000 homens com mais de 65 anos) e mulheres (9.0 por 10.000 mulheres com idade entre 20 e 64 anos anos versus 26.1 casos por 10.000 mulheres com mais de 65 anos).
duzentos e oito (55%) casos confirmados também relataram aumento da susceptibilidade à doença mais frequentemente devido ao tabagismo e doença cardíaca respiratória crónica.
identificação da fonte
quarenta e nove fontes possíveis; nacionais, públicos, comerciais e industriais (5) foram identificados e reduzidos para quatro fontes potenciais após investigação ambiental. Todos os quatro eram indústrias com sistemas de refrigeração húmidos.Três das quatro fontes potenciais relataram casos suspeitos entre os empregados, nove casos foram confirmados.
análise microbiológica e fenotípica e caracterização genética
o laboratório de referência recebeu 95 amostras ambientais de 49 fontes possíveis, das quais, culturas positivas de L. pneumophila foram isoladas em 8. Estas amostras são provenientes de quatro indústrias com sistemas de arrefecimento por via húmida e de um estabelecimento comercial. Seis das 8 culturas positivas foram l. pneumophila sg 2-15 (75%). A L. pneumophila sg 1 foi isolada a partir de duas amostras ambientais colhidas na mesma torre de um sistema industrial, as concentrações registadas foram de 1,42×106ufc/l em 8 de novembro e de 421ufc/l em 10 de novembro. A tipagem sequencial destes dois isolados ambientais identificou o novo genótipo ST1905.
a confirmação laboratorial dos casos foi feita através de testes urinários de antigénios para L. pneumophila sg 1 (92%); seroconversão( 2%); PCR (3%) e título único para L. pneumophila (3%). 152 amostras clínicas foram enviadas para o laboratório de referência. Destes, 71 revelaram a presença de L. pneumophila sg 1 com perfil SBT idêntico.
37 isolados de L. pneumophila sg 1 foram submetidos a caracterização fenotípica, 35 isolados de amostras clínicas e dois de amostras ambientais. Todos os 37 isolados apresentaram a mesma característica fenotípica; subtipo França / Allentown e possuíam o epítopo associado à virulência reconhecido pelo anticorpo monoclonal MAb 3/1 (Fig. 3).
processamento Microbiolológico e resultados de amostras clínicas.
Para confirmar a relação genética de ST1905 isola, de 10 de 71 isolados clínicos e um ambiente positivo isolar obtidos a partir industrial, torre de resfriamento foram nominalmente selecionado para o sequenciamento do genoma. Conseguimos usar cerca de 99.8% de cada sequência de rascunho e não encontraram diferenças nucleotídicas dentro dos 3,47 Mb comparados do genoma. A análise filogenética envolvendo múltiplos isolados de L. pneumophila de todo o mundo revelou que o aglomerado de ST1905 divergia claramente do ramo que agrupava as estirpes de L. pneumophila mais estudadas (serogrupos 1, 6 e 12)17-19 e estava mais intimamente relacionado com L. pneumophila subsp. estirpes de fraseri (serogroup 4, 5 e 15).20 WGS confirmation of the ST1905 allelic profile highlighted a bias associated with the in silico extraction of the allele sequence for the mompS locus. The studied strain displayed non-matching mompS copies, which hurded a proper ST attribution if SBT was exclusively determined in silico(Fig. 4).
árvore filogenética comparando toda a sequência do genoma de isolados ambientais e clínicos.
resultados meteorológicos, climáticos e de qualidade do ar
temperaturas acima da média mensal foram registrados de 18 de outubro a 1 de novembro (>20°C), com uma inversão térmica noturna persistente associada a um vento predominante NE e NNE com velocidade de 2–3km/h. A última semana de outubro teve mais de 80% de Umidade Relativa, com períodos superiores a 90%. Outubro de 2014 foi o Outubro mais quente de Portugal continental desde 1931, incluindo uma onda de calor de 11 dias durante o período de 17-27 de outubro. De 19 de outubro a 1 de novembro, três vezes o nível recomendado de partículas (PM10) e os valores semanais mais elevados em 2014, foi registrado na estação de qualidade do ar local, atribuído a um forte episódio de poeira do Saara transportado para Portugal continental.
Período de avaliação da exposição
O melhor de back-modelos de cálculo sugerido um crescimento logístico da exposição ambiental, com maior intensidade entre 16 de outubro e 4 de novembro (Fig. 1).
resultados da análise de proximidade da fonte
quando a análise de proximidade da fonte foi realizada, houve 365 casos confirmados, dos quais 328 (90%) foram geo-referenciados a 10 km de uma das quatro fontes potenciais (Fig. 5).
doença dos Legionários perto de quatro indústrias com sistemas de refrigeração húmidos por distância de residência da(S) torre (s).
todas as quatro fontes potenciais demonstraram uma diminuição significativa do risco de doença com o aumento da distância (agrupamento) no Quadrante SW. O maior agrupamento (ST157, p
0, 001) foi observado no quadrante SW da indústria 1. Foi também observado o agrupamento com a indústria 2 (ST 117, p0.001), a indústria 3 (ST 126, p0.001) e a indústria 4 (ST 66.1, p0.001). O risco de doença caiu consistentemente com a crescente distância da fonte, sem evidência de picos ou fossos neste quadrante. Nenhum agrupamento foi observado nos quadrantes SE de qualquer indústria, uma área que em grande parte compreendia o rio. A indústria 1 e 2 demonstraram um menor grau de agrupamento no quadrante NE (ST 5, p=0, 01 E ST 4, 2, p=0, 01 respectivamente). O agrupamento também foi demonstrado no quadrante NW da indústria 1 (ST 3.9, p=0,01).Discussão
identificámos quatro indústrias com sistema de arrefecimento por via húmida como as fontes mais prováveis do segundo maior surto de doença dos Legionários registado com 403 casos e 14 mortes. Concentrações elevadas de L. pneumophila sg 1 ST1905 demonstrando o virulento subgrupo MAb 3-1 foram identificados nas torres de uma indústria. Usando SBT e WGS, pudemos confirmar a relação genética das estirpes clínicas e ambientais associadas ao surto. Os únicos isolados positivos para L. pneumophila sg 1, foram ambos Obtidos da torre de resfriamento de uma indústria. Concentrações similares de L. pneumophila foram isoladas em outras torres de resfriamento associadas a surtos.5 é provável, embora não comprovado que a contaminação cruzada das quatro torres localizadas de perto contribuiu para a magnitude do surto e já foi descrita anteriormente.21
as temperaturas quentes não sazonais registadas durante Outubro de 2014 suportaram a proliferação de espécies de Legionelas em sistemas de torres de arrefecimento.As concentrações elevadas de PM10 podem ter actuado como núcleos de concentração de nuvens que facilitam a formação de aerossóis. A distribuição e grande número de casos são contabilizados pelo vento NE, alta umidade Relativa e inversão térmica observados durante o período de libertação estimado, além da longevidade23 e elevada virulência24 de uma bactéria com epítopo MAb3/1.
o surto ocorreu numa área densamente povoada perto da capital de Portugal, contendo rotas suburbanas fortemente utilizadas. O número real de pessoas expostas era provável que tivesse sido muito maior do que a população residente. Testes de diagnóstico padrão podem não detectar todos os casos.3 os valores apresentados não contêm casos de febre Pontiac ou casos suspeitos que apresentaram resultados negativos e, por conseguinte, provavelmente subestimam a morbilidade vivida pela comunidade e o impacto nos Serviços de saúde locais. Em contrapartida, devido à presença de notificação electrónica de morte em Portugal, foi possível assegurar que a informação sobre se um caso tinha morrido estava completa. O caso de fatalidade observado (3,5% de todos os casos) foi menor do que os 6% geralmente observados em surtos associados a Torres e sistemas de resfriamento.8 a estirpe causativa do surto agrupou-se filogeneticamente para além das estirpes L. pneumophila sg 1, mais estudadas (Lp Philadelphia-1, Lp Paris, Lp Lens, Lp Corby e Lp 2300/99 Alcoy). It was found to be closely related to L. pneumophila subsp. estirpes fraseri de serogrupos diferentes da sg 1. A estirpe estudada possui uma exclusiva região genômica ∼38kb em comparação com a próxima estirpe mais filogeneticamente relacionada. Esta região foi considerada intacta e altamente similar (BLASTn, cobrir 100%, identidade 99%, E-value 0.0) apenas numa estirpe (ATCC 33761=DSM 21215) de L. oakridgensis, uma espécie que raramente causa a doença dos Legionários.25 explicaríamos a baixa fatalidade de casos observada em termos de diagnóstico precoce e tratamento apropriado e oportuno, se os traços únicos da estirpe associada ao surto estão subjacentes a características importantes da letalidade permanece em estudo.
a análise de proximidade da fonte estimou o número esperado de Casos da população residente, o que provavelmente levou a uma subestimação da exposição. Nós raciocinamos que a informação residencial foi coletada sistematicamente, ao contrário da história do deslocamento, também as condições para a propagação horizontal dos aerossóis eram mais pronunciadas na hora da noite quando a maioria dos residentes estaria em suas casas. Uma abordagem mais robusta teria de realizar a análise como parte de um estudo de caso de controlo, que poderia também incluir exposições em não residentes. Embora inicialmente discutido, não procedemos com um estudo de caso–controle devido a restrições de recursos e tempo. A proximidade geográfica próxima das torres significava que havia sobreposição de algumas das áreas de estudo tornando possível, mas improvável que uma fonte localizada De Perto poderia levar à presença de uma relação de declínio à distância para outra fonte. A comparação da distribuição geoespacial de casos com a modelagem de plumas de aerossol poderia ser de valor para avaliar o impacto de fontes localizadas de perto umas nas outras.
este surto foi o segundo maior surto de doença dos Legionários registado até à data e acrescenta ao conjunto de provas relativas ao impacto das condições climáticas e dos fenótipos bacterianos na torre de arrefecimento, associados a surtos comunitários de doença dos Legionários.
conflitos de interesses
os autores não têm conflitos de interesses a declarar.