Introducere
la 7 noiembrie 2014, Direcția Generală a Sănătății din Portugalia a fost informată de un laborator spitalicesc local de 18 pacienți cu boală Legionară, toți internați în ultimele 24 de ore de la Vila Franca de Xira, oraș de la periferia capitalei Lisabona. A devenit rapid evident că numărul cazurilor a crescut și au fost identificate cazuri din toată Portugalia. Un grup de lucru multidisciplinar a investigat focarul, rezultatele anchetei preliminare au condus la închiderea sistemelor industriale de răcire umedă. În timpul investigației focarului, am prezentat un raport care a fost publicat ca o comunicare rapidă, oferind date preliminare ale investigației epidemiologice, microbiologice și de mediu.1 Acest articol prezintă rezultatele finale ale anchetei focarului.
boala legionarilor, descrisă pentru prima dată în timpul conferinței Legiunii Americane Philadelphia din 19762 este o infecție pneumonică bacteriană cu specii Legionellae. Cele mai multe cazuri atribuite bolii L. pneumophila SG 1.3 se dezvoltă caracteristic la 2-10 zile după inhalarea bacteriilor aerosolizate de către persoanele sensibile. Factorii de risc includ fumatul, persoanele în vârstă și cei cu boală cardiorespiratorie cronică.4 apa, fie în medii acvatice naturale, fie artificiale, este rezervorul pentru speciile Legionellae.5
din 2008 până în 2012, în Portugalia au fost raportate anual între 88 și 140 de cazuri, dintre care majoritatea au fost cazuri dobândite sporadic în comunitate.6 focare comunitare mari pot duce la morbiditate și mortalitate semnificative într-un interval scurt de timp,5 cel mai mare până în prezent a fost raportat în 2001 în Murcia, Spania, cu 449 de cazuri.7
identificate frecvent ca sursă de focare comunitare mari, sursele sistemelor turnurilor de răcire industriale8 sunt capabile să difuzeze aerosoli contaminați pe distanțe mari.9 factorii meteorologici, condițiile operaționale industriale și întreținerea inadecvată sunt factori de risc pentru focarele de Legionella asociate turnurilor.8,10
Metodedefiniții
un caz confirmat de boală Legionară a avut pneumonie confirmată radiologic cu debut de simptom între 12 octombrie 02 decembrie 2014, care a trăit sau a lucrat la mai puțin de 10 km de Vila Franca de Xira și a avut confirmarea de laborator a infecției. Criteriile de laborator pentru un caz confirmat au inclus izolarea Legionella spp. din secrețiile respiratorii, detectarea L. antigenul pneumophila SG1 în urină, o creștere semnificativă a nivelului specific de anticorpi la L. pneumophila SG 1 în probele de ser pereche. Am definit un caz probabil diferit doar în detectarea în laborator a oricărei Legionella spp. acid nucleic în secrețiile respiratorii sau un singur nivel ridicat de anticorp specific la L. pneumophila SG 1.
identificarea cazurilor și evaluarea expunerii
cazurile au fost identificate prin revizuirea notificărilor clinice legale de laborator și electronice începând cu 1 octombrie 2014. Personalul autorităților regionale de sănătate a intervievat toate cazurile confirmate și probabile aplicând un chestionar standard al bolii legionarilor portughezi care a înregistrat detalii demografice, epidemiologice și clinice. Adresa rezidențială a fiecărui caz a fost geocodificată în Google Earth.
pentru a identifica decesele, am comparat în mod regulat baza de date a focarelor cu sistemul portughez de informații în timp real pentru certificarea deceselor (Sico), din noiembrie 2014 până în martie 2015.
identificarea sursei
au fost identificate posibile surse de contaminare cu Legionella, inclusiv industriile cu sisteme de răcire umedă, spitale, mall-uri și facilități publice de recreere și, ca măsură de precauție, au fost închise până la investigația de mediu. S-au verificat rapoartele operaționale și de întreținere și s-au prelevat probe pentru depistarea prezenței Legionella spp., rezultatele au condus la identificarea surselor potențiale. Locațiile surselor potențiale au fost mapate folosind identificarea vizuală în Google Earth.
caracterizare microbiologică, fenotipică și genotipică
detectarea antigenului L. pneumophila SG 1 a fost efectuată utilizând teste specifice ale antigenului urinar în laboratoarele spitalicești. Probele respiratorii și de sânge au fost procesate la laboratorul de referință, Institutul Național de sănătate Dr.Ricardo Jorge. Probele de mediu au fost obținute în timpul inspecțiilor efectuate de Inspectoratul General pentru agricultură, mare, mediu și amenajarea teritoriului în conformitate cu reglementările portugheze și prelucrate de laboratorul de referință, Institutul Național de sănătate Dr.Ricardo Jorge.
probele clinice și de mediu au fost analizate folosind tehnici de cultură și/sau moleculare. Probele clinice au fost cultivate pe medii bazate pe BCYE, iar probele de mediu au fost cultivate în medii selective GVPC. Izolatele au fost identificate prin kituri Comerciale de latex-aglutinare (Legionella latex Test, Oxoid, Regatul Unit și Microgen Legionella, Microgen inkt Bioproducts,). Rezultatele culturii pentru probele clinice au fost verificate prin PCR în timp real țintite la genele 16S și/sau mip (L. pneumophila Real-TM, Sacace Biotechnologies, Italia; Argene Legio pneumo/Cc R-gene, biomecrieux, Franța). Izolatele sau specimenele de cultură negative/PCR pozitive au fost caracterizate prin tastarea pe bază de secvență (SBT) în conformitate cu orientările Grupului European de lucru pentru infecțiile cu Legionella (EWGLI).11 cei șapte loci au fost supuși secvențierii Sanger prin utilizarea chimiei BigDye v1.1 pe un analizor Genetic 3130xl (biosisteme aplicate). Secvențierea întregului genom (WGS) a fost efectuată pentru 10 probe clinice și o probă de mediu pe un instrument MiSeq (Illumina Inc., San Diego, SUA) folosind utilizarea celulelor de flux MiSeq V2 și citiri cu capăt pereche de 150bp (adâncimea de acoperire >de 100 de ori) pentru a stabili asemănarea lor. Citirile Illumina au fost asamblate folosind versiunea Velvet 1.2.10.12
caracterizarea fenotipică a L. pneumophila sg1 a utilizat panoul de anticorpi monoclonali din Dresda (Mab) format din șase Mab plus MAb 3 din panoul internațional obținut din colecția de cultură de tip American (ATCC). Analiza a urmat un algoritm stabilit, aprobat de EWGLI, care poate caracteriza L. pneumophila într-unul din cele nouă subgrupuri; Knoxville, Philadelphia, Franța/Allentown, Benidorm, OLDA, Oxford, Heysham, Camperdown și Bellingham.13 Panoul a inclus anticorpi la MAb 3/1, care este considerat un marker de virulență datorită hidrofobicității ridicate a acestor tulpini.
Aspecte meteorologice și de calitate a aerului
datele au fost obținute de la stația meteo din Vila Franca de Xira și de la stația locală de calitate a aerului (Alverca). Pentru perioada 18 octombrie–1 noiembrie 2014 au fost colectate înregistrări de două ori pe zi ale temperaturii și înregistrări o dată pe zi ale umidității, calității aerului, vitezei și direcției vântului.
analiza statistică
am efectuat o analiză de proximitate a sursei a patru surse potențiale pentru a testa ipoteza că riscul de boală a fost invers legat de Distanța față de sursă. Folosind software-ul QGIS, un tampon cu o rază de 10 km subdivizat în inele concentrice de 1 km a fost plasat pe turnurile fiecărui sistem industrial de răcire. Tamponul și inelele au fost apoi împărțite în patru cadrane, Nord-Est, Sud-Est, Sud-Vest și nord-vest. Am comparat numărul de cazuri cu numerele așteptate. Pentru a calcula cazurile așteptate, ratele specifice vârstei și sexului pentru focar au fost aplicate numărului de populație din subsecțiune de la recensământul din 2011. Subsecțiunile au fost clasificate în funcție de distanța și direcția centroidului lor geografic de la fiecare sursă. Numărul așteptat de cazuri pentru fiecare cadran de bandă a fost calculat ca suma cazurilor așteptate pentru subsecțiunile ale căror centroizi se aflau în el. Folosind testul Stones (ST), am testat raporturile observate la cele așteptate pentru scăderea riscului, cu o distanță de până la 10 km în nord-est, nord-vest, sud-est și Sud-Vest14 cu 9999 simulări Monte Carlo și am stabilit limita pentru semnificația statistică la 0,05,15
modele de calcul spate dezvoltate de Egan și colab.16 au fost utilizate pentru a estima perioada de eliberare aerosolizată la începutul focarului. Modelele au fost repetate folosind cazuri notificate până în martie 2015. Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul statistic R.
Rezultatedescrierea întreruperii
până la 2 decembrie 2014, au fost identificate 403 cazuri de boală, dintre care 377 confirmate și 26 de cazuri probabile. Paisprezece persoane au murit (caz de deces 3,5%).
cazul confirmat a dezvoltat simptome între 14 octombrie și 2 decembrie 2014. Numărul cazurilor a atins punctul culminant la 6 noiembrie, iar focarul a fost declarat la 7 noiembrie (Fig. 1).
cazuri confirmate de boală Legionară după data apariției simptomelor, Vila Franca de Xira, Portugalia, 14 octombrie-2 decembrie 2014 (n=377).
cele mai mari rate de atac s-au văzut în parohia din P Xvvoa de Santa Iria/Forte de Casa (60 la 10.000 de locuitori) și au scăzut odată cu creșterea distanței față de această parohie (Fig. 2).
harta care arată rata de atac a bolii legionarilor în funcție de locul de reședință (parohie), Vila Franca de Xira, Portugalia.
au existat 252 de cazuri confirmate la bărbați (66%). Vârsta medie a fost de 59 de ani, rata atacului a fost mai mare la bărbați și a crescut odată cu vârsta la ambele sexe (25,1 la 10.000 de bărbați cu vârsta cuprinsă între 20 și 64 de ani față de 37,9 la 10.000 de bărbați cu vârsta peste 65 de ani) și femei (9,0 la 10.000 de femei cu vârsta cuprinsă între 20 și 64 de ani față de 26,1 cazuri la 10.000 de femei cu vârsta peste 65 de ani).
două sute opt (55%) cazuri confirmate au raportat, de asemenea, o sensibilitate crescută la boală, cel mai frecvent din cauza fumatului și a bolilor cronice cardio-respiratorii.
identificarea surselor
patruzeci și nouă de surse posibile; interne, publice, comerciale și industriale (5) au fost identificate și reduse la patru surse potențiale în urma investigațiilor de mediu. Toate cele patru erau industrii cu sisteme de răcire umedă.
trei din cele patru surse potențiale au raportat cazuri suspecte în rândul angajaților, nouă cazuri au fost confirmate.
analiza microbiologică și fenotipică și caracterizarea genetică
laboratorul de referință a primit 95 de probe de mediu din 49 de surse posibile, dintre care, culturile pozitive L. pneumophila au fost izolate în 8. Aceste probe provin din patru industrii cu sisteme de răcire umedă și un spațiu comercial. Șase din cele 8 culturi pozitive au fost L. pneumophila sg 2-15 (75%). L. pneumophila SG 1 au fost izolate din doua probe de mediu prelevate din acelasi turn al unui sistem industrial, concentratiile inregistrate fiind de 1,42 106 UFC / l la 8 noiembrie si 421 UFC / l la 10 noiembrie. Tastarea pe bază de secvență a acestor două izolate de mediu a identificat noul genotip ST1905.
confirmarea de laborator a cazurilor s-a făcut prin testarea antigenului urinar pentru L. pneumophila sg 1 (92%); seroconversie (2%); PCR (3%) și titru unic pentru L. pneumophila (3%). 152 de probe clinice au fost trimise la laboratorul de referință. Dintre acestea, 71 au evidențiat prezența L. pneumophila SG 1 cu profil identic ST1905 SBT.
37 izolate de L. pneumophila SG 1 au suferit caracterizări fenotipice, 35 izolate din probe clinice și două din probe de mediu. Toate cele 37 de izolate au prezentat aceeași caracteristică fenotipică; subtipul France / Allentown și poseda epitopul asociat virulenței recunoscut de anticorpul monoclonal MAb 3/1 (Fig. 3).
prelucrarea microbiologică și rezultatele probelor clinice.
pentru a confirma legătura genetică a izolatelor ST1905, 10 din cele 71 de izolate clinice și un izolat pozitiv de mediu obținut din turnul de răcire industrial au fost selectate nominal pentru secvențierea întregului genom. Am reușit să folosim aproximativ 99.8% din fiecare secvență de proiect și nu a găsit diferențe de nucleotide în cadrul celor 3,47 Mb comparați ai genomului. Analiza filogenetică care a implicat mai multe izolate de L. pneumophila din întreaga lume a relevat faptul că clusterul ST1905 a deviat în mod clar de la ramura care a înscris cele mai studiate tulpini de L. pneumophila (serogrupurile 1, 6 și 12)17-19 și a fost mai strâns legat de L. pneumophila subsp. tulpini fraseri (serogrupul 4, 5 și 15).Confirmarea 20 WGS a profilului alelic ST1905 a evidențiat o prejudecată asociată cu extracția in silico a secvenței de alele pentru locusul mompS. Tulpina studiată a prezentat copii mompS care nu se potrivesc, ceea ce a împiedicat o atribuire ST adecvată dacă SBT a fost determinată exclusiv în silico (Fig. 4).
arborele filogenetic comparând întreaga secvență genomică a izolatelor de mediu și clinice.
rezultatele meteorologice, climatice și de calitate a aerului
temperaturile peste media lunară au fost înregistrate în perioada 18 octombrie–1 noiembrie (> 20 C), cu o inversiune termică nocturnă persistentă asociată cu un vânt predominant NE și NNE cu viteză de 2-3km/h. Ultima săptămână a lunii octombrie a avut o umiditate relativă de peste 80%, perioadele depășind 90%. Octombrie 2014 a fost cel mai cald octombrie din Portugalia continentală din 1931, incluzând un val de căldură de 11 zile în perioada 17-27 octombrie. În perioada 19 octombrie-1 noiembrie, de trei ori nivelul recomandat de particule (PM10) și cele mai mari valori săptămânale din 2014, a fost înregistrat în stația locală de calitate a aerului, atribuită unui episod puternic de praf Sahara transportat în Portugalia continentală.
perioada de evaluare a expunerii
cele mai potrivite modele de back-calcul au sugerat o creștere logistică a expunerii mediului, cu cea mai mare intensitate între 16 octombrie și 4 noiembrie (Fig. 1).
rezultatele analizei proximității sursei
când s-a efectuat analiza proximității sursei, au existat 365 de cazuri confirmate, dintre care 328 (90%) au fost geo-referențiate la o distanță de 10 km de una dintre cele patru surse potențiale (Fig. 5).
boala legionarilor în apropierea a patru industrii cu sisteme de răcire umedă în funcție de Distanța de reședință față de turn(e).
toate cele patru surse potențiale au demonstrat o scădere semnificativă a riscului de boală odată cu creșterea distanței (clustering) în cadranul SW. Cea mai mare grupare (ST157, p
0,001) a fost observată în cadranul SW al industriei 1. Gruparea a fost observată și cu industria 2 (ST 117, p0.001), industria 3 (ST 126, p0.001) și industria 4 (ST 66.1, p0.001). Riscul de îmbolnăvire a scăzut în mod constant odată cu creșterea distanței față de sursă, fără dovezi de vârfuri sau jgheaburi în acest cadran. Nu s-a observat nicio grupare în cadranele SE ale oricărei industrii, o zonă care cuprindea în mare parte râul. Industria 1 și 2 au demonstrat un grad mai scăzut de grupare în cadranul NE (ST 5, p=0,01 și ST 4,2, p=0,01 respectiv). Gruparea a fost demonstrată și în cadranul NW al industriei 1 (ST 3.9, p=0.01).Discuție
am identificat patru industrii cu sistem de răcire umedă ca fiind cele mai probabile surse ale celui de-al doilea focar de boală Legionară înregistrat cu 403 cazuri și 14 decese. Concentrații crescute de L. pneumophila SG 1 ST1905 demonstrând subgrupul virulent MAb 3-1 au fost identificate în turnurile unei industrii. Folosind SBT și WGS, am putut confirma legătura genetică a tulpinilor clinice și de mediu asociate focarului. Singurele izolate pozitive pentru L. pneumophila SG 1, ambele au fost obținute din turnul de răcire al unei industrii. Concentrații similare de L. pneumophila au fost izolate în alte turnuri de răcire asociate cu focare.5 este probabil, deși nedovedit, că contaminarea încrucișată a celor patru turnuri apropiate a contribuit la amploarea focarului și a fost descrisă anterior.21
temperaturile neobișnuit de calde înregistrate în octombrie 2014 au susținut proliferarea speciilor Legionellae în sistemele turnurilor de răcire.22 concentrațiile mari de PM10 ar fi putut acționa ca nuclee de concentrație a norilor care facilitează formarea aerosolilor. Distribuția și numărul mare de cazuri sunt contabilizate de vântul NE, umiditatea relativă ridicată și inversiunea termică observată în timpul perioadei de eliberare estimate, pe lângă longevitatea23 și virulența sporită24 a unei bacterii cu epitop MAb3/1.
focarul a avut loc într-o zonă dens populată din apropierea capitalei Portugaliei, care conținea rute de navetiști puternic utilizate din zonele suburbane. Numărul real de persoane expuse a fost probabil să fi fost mult mai mare decât populația rezidentă. Este posibil ca testele de diagnostic Standard să nu detecteze toate cazurile.3 cifrele prezentate nu conțin cazuri de febră Pontiac sau cazuri suspectate care au dat rezultate negative și, prin urmare, subestimează probabil morbiditatea experimentată de comunitate și impactul asupra serviciilor locale de sănătate. În schimb, datorită prezenței notificării electronice a decesului în Portugalia, a fost posibil să se asigure că informațiile privind decesul unui caz erau complete. Fatalitatea cazurilor observate (3,5% din toate cazurile) a fost mai mică decât 6% observată de obicei în focarele asociate turnurilor și sistemelor de răcire.8 tulpina cauzală a focarului s-a grupat filogenetic în afară de cele mai studiate tulpini L. pneumophila SG 1 asociate focarului (LP Philadelphia-1, LP Paris, LP Lens, LP Corby și LP 2300/99 Alcoy). S-a constatat că este strâns legată de L. pneumophila subsp. tulpini de fraseri din alte serogrupuri decât sg 1. Tulpina studiată adăpostește o regiune genomică exclusivă de 38kb, în comparație cu următoarea tulpină cu cea mai mare legătură filogenetică. Această regiune s-a dovedit a fi intactă și foarte asemănătoare (BLASTn, acoperire 100%, identitate 99%, valoare E 0,0) numai într-o singură tulpină (ATCC 33761=DSM 21215) de L. oakridgensis, o specie care rareori provoacă boala legionarilor.25 am explica fatalitatea scăzută a cazurilor observată în ceea ce privește diagnosticul precoce și tratamentul adecvat și în timp util, dacă trăsăturile unice ale tulpinii asociate focarului stau la baza caracteristicilor importante ale letalității rămân în studiu.
analiza proximității sursei a estimat numărul așteptat de cazuri din populația rezidentă, ceea ce a condus probabil la o subestimare a expunerii. Am argumentat că informațiile rezidențiale au fost colectate sistematic, spre deosebire de istoricul deplasărilor, de asemenea, condițiile pentru propagarea orizontală a aerosolilor erau mai pronunțate noaptea, când majoritatea locuitorilor ar fi fost în casele lor. O abordare mai robustă ar trebui să efectueze analiza ca parte a unui studiu de control de caz, care ar putea include, de asemenea, expuneri la nerezidenți. Deși s–a discutat inițial, nu am continuat cu un studiu de caz-control din cauza constrângerilor de resurse și timp. Apropierea geografică apropiată a turnurilor a însemnat că a existat o suprapunere a unora dintre zonele de studiu făcând posibil, dar puțin probabil ca o sursă apropiată să poată duce la prezența unei relații de declin la distanță pentru o altă sursă. Compararea distribuției geospațiale a cazurilor cu modelarea penelor de aerosoli ar putea fi de valoare pentru a evalua impactul surselor apropiate unul asupra celuilalt.
acest focar a fost al doilea cel mai mare focar de boală Legionară înregistrat până în prezent și se adaugă la corpul de dovezi cu privire la impactul condițiilor climatice și al fenotipurilor bacteriene în focarele comunitare asociate turnului de răcire ale bolii legionarilor.
conflicte de interese
autorii nu au conflicte de interese de declarat.