Introducción
El 7 de noviembre de 2014, un laboratorio hospitalario local informó a la Dirección General de Salud de Portugal de 18 pacientes con enfermedad del Legionario, todos ingresados en las 24 horas anteriores desde Vila Franca de Xira, ciudad a las afueras de la capital, Lisboa. Rápidamente se hizo evidente que el número de casos iba en aumento y se detectaron casos en todo Portugal. Un grupo de trabajo multidisciplinario investigó el brote, los resultados de su investigación preliminar llevaron al cierre de los sistemas industriales de refrigeración húmeda. Durante la investigación del brote, presentamos un informe que se ha publicado como comunicación rápida, proporcionando datos preliminares de la investigación epidemiológica, microbiológica y ambiental.1 Este artículo presenta los resultados finales de la investigación del brote.
La enfermedad del Legionario, descrita por primera vez durante la conferencia de la Legión Americana de Filadelfia de 19762, es una infección neumónica bacteriana con especies de Legionelas. La mayoría de los casos atribuidos a la enfermedad de L. pneumophila sg 1.3 se desarrollan característicamente 2-10 días después de la inhalación de bacterias aerosolizadas por individuos susceptibles. Los factores de riesgo incluyen el tabaquismo, las personas mayores y las personas con enfermedad cardiorrespiratoria crónica.4 El agua, ya sea en ambientes acuáticos naturales o artificiales, es el reservorio de especies de Legionelas.5
De 2008 a 2012, se notificaron entre 88 y 140 casos anuales en Portugal, de los cuales la mayoría fueron casos esporádicos adquiridos en la comunidad.6 Los brotes comunitarios de gran tamaño pueden dar lugar a una morbilidad y mortalidad significativas en un corto espacio de tiempo,5 el mayor hasta la fecha se notificó en 2001 en Murcia, España, con 449 casos.7
La fuente de los sistemas de torres de refrigeración industriales, a menudo identificada como la fuente de grandes brotes en la comunidad, 8 es capaz de diseminar aerosoles contaminados a grandes distancias.9 Los factores meteorológicos, las condiciones operativas industriales y el mantenimiento inadecuado son factores de riesgo para brotes de legionella asociados con las torres.8,10
MetododEfiniciones
Un caso confirmado de enfermedad del Legionario tenía neumonía radiológicamente confirmada con inicio sintomático entre el 12 de octubre y el 02 de diciembre de 2014, que vivía o trabajaba a menos de 10 km de Vila Franca de Xira y tenía confirmación de laboratorio de infección. Los criterios de laboratorio para un caso confirmado incluyeron el aislamiento de Legionella spp. a partir de secreciones respiratorias, la detección de L. antígeno pneumophila sg1 en orina, aumento significativo del nivel de anticuerpos específicos frente a L. pneumophila sg 1 en muestras de suero pareadas. Definimos un caso probable que difería solo en la detección de laboratorio de cualquiera de las especies de Legionella. ácido nucleico en secreciones respiratorias o un único nivel alto de anticuerpo específico contra L. pneumophila sg 1.
Identificación de casos y evaluación de la exposición
Se identificaron casos mediante la revisión de las notificaciones clínicas electrónicas y de laboratorio reglamentarias a partir del 1 de octubre de 2014. El personal de las autoridades sanitarias regionales entrevistó a todos los casos confirmados y probables aplicando un cuestionario estándar de enfermedad del Legionario portugués que registraba detalles demográficos, epidemiológicos y clínicos. La dirección residencial de cada caso fue geocodificada en Google Earth.
Para identificar muertes, comparamos regularmente la base de datos de brotes con el sistema portugués de información en tiempo real para la certificación de defunciones (SICO), de noviembre de 2014 a marzo de 2015.
Identificación de la fuente
Se identificaron posibles fuentes de contaminación por Legionela, incluidas industrias con sistemas de refrigeración húmeda, hospitales, centros comerciales e instalaciones recreativas públicas, y, como medida de precaución, se cerraron hasta la investigación ambiental. Se revisaron los informes operativos y de mantenimiento y se tomaron muestras para detectar la presencia de Legionella spp., los resultados llevaron a la identificación de posibles fuentes. Las ubicaciones de las fuentes potenciales se mapearon utilizando la localización visual en Google Earth.
Caracterización microbiológica, fenotípica y genotípica
La detección del antígeno L. pneumophila sg 1 se realizó mediante pruebas específicas de antígeno urinario en laboratorios hospitalarios. Se procesaron muestras respiratorias y de sangre en el laboratorio de referencia, el Instituto Nacional de Salud Dr. Ricardo Jorge. Las muestras ambientales se obtuvieron durante las inspecciones realizadas por la Inspección General de Agricultura, Mar, Medio Ambiente y Ordenación del Territorio de conformidad con la normativa portuguesa, y fueron procesadas por el laboratorio de referencia del Instituto Nacional de Salud, Dr. Ricardo Jorge.
Se analizaron muestras clínicas y ambientales mediante cultivo y / o técnicas moleculares. Las muestras clínicas se cultivaron en medios basados en BCYE y las muestras ambientales se cultivaron en medios selectivos de GVPC. Los aislados se identificaron mediante kits comerciales de aglutinación de látex (Prueba de látex de Legionella, Oxoid, Reino Unido y Legionella de Microgen, Bioproductos de Microgen®). Los resultados de cultivo de las muestras clínicas se comprobaron mediante PCR en tiempo real dirigida a los genes 16S y/o mip (L. pneumophila Real-TM, Sacace Biotechnologies, Italia; Argene Legio pneumo/Cc r-gen, bioMérieux, Francia). Los aislados, o muestras con cultivo negativo/PCR positivo, se caracterizaron por tipificación basada en secuencias (SBT) de acuerdo con las directrices del Grupo de Trabajo Europeo para Infecciones por Legionella (EWGLI).11 Los siete loci se sometieron a secuenciación Sanger mediante el uso de química BigDye v1.1 en un Analizador Genético 3130XL (Sistemas Biológicos Aplicados). La secuenciación del genoma completo (WGS) se realizó para 10 muestras clínicas y una ambiental en un instrumento MiSeq (Illumina Inc., San Diego, EE. UU.) utilizando celdas de flujo MiSeq V2 y lecturas de extremo emparejado de 150 bp (profundidad de cobertura >100 veces) para determinar su similitud. Las lecturas de Illumina se ensamblaron utilizando la versión Velvet 1.2.10.12
Caracterización fenotípica de L. pneumophila sg1 utilizó el panel Dresden de anticuerpos monoclonales (MAbs) compuesto por seis MAbs más el MAb 3 del Panel Internacional obtenido de la American Type Culture Collection (ATCC). El análisis siguió un algoritmo establecido, avalado por EWGLI, que puede caracterizar a L. pneumophila en uno de los nueve subgrupos; Knoxville, Filadelfia, Francia/Allentown, Benidorm, OLDA, Oxford, Heysham, Camperdown y Bellingham.13 El panel incluyó anticuerpos contra MAb 3/1, que se considera un marcador de virulencia debido a la alta hidrofobicidad de estas cepas.
Aspectos meteorológicos y de calidad del aire
Se obtuvieron datos de la estación meteorológica de Vila Franca de Xira y de la estación local de calidad del aire (Alverca). Durante el período comprendido entre el 18 de octubre y el 1 de noviembre de 2014, se recogieron registros de temperatura dos veces al día y registros de humedad, calidad del aire, velocidad y dirección del viento una vez al día.
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de proximidad de la fuente de cuatro fuentes potenciales para probar la hipótesis de que el riesgo de enfermedad estaba inversamente relacionado con la distancia de la fuente. Utilizando el software QGIS, se colocó un búfer de radio de 10 km subdividido en anillos concéntricos de 1 km en las torres de cada sistema de refrigeración industrial. El amortiguador y los anillos se dividieron en cuatro cuadrantes, Noreste, Sureste, Suroeste y Noroeste. Comparamos el número de casos con los números esperados. Para calcular los casos esperados, se aplicaron las tasas específicas de edad y sexo para el brote a los recuentos de población de la subsección del censo de 2011. Las subsecciones se clasificaron de acuerdo con la distancia y dirección de su centroide geográfico desde cada fuente. El número esperado de casos para cada cuadrante de banda se calculó como la suma de los casos esperados para las subsecciones cuyos centroides se encontraban dentro de él. Utilizando la Prueba de Stones (ST), probamos las proporciones observadas y esperadas para la disminución del riesgo, con una distancia de hasta 10 km en el Noreste, Noroeste, Sureste y Sudoeste 14 con 9999 simulaciones de Monte Carlo y fijamos el límite de significancia estadística en 0,05,15
Modelos de cálculo retrospectivo desarrollados por Egan et al.se utilizaron 16 para estimar el período de liberación de aerosoles al comienzo del brote. Los modelos se repitieron utilizando casos notificados hasta marzo de 2015. El análisis estadístico se realizó con el software estadístico R.
Resultados Descripción de la ruptura
Al 2 de diciembre de 2014, se identificaron 403 casos de enfermedad, de los cuales 377 confirmados y 26 probables. Catorce personas murieron (3,5% de víctimas mortales).
El caso confirmado presentó síntomas entre el 14 de octubre y el 2 de diciembre de 2014. El número de casos alcanzó su punto máximo el 6 de noviembre y el brote se declaró el 7 de noviembre (Fig. 1).
Casos confirmados de Legionelosis por fecha de inicio de los síntomas, Vila Franca de Xira, Portugal, 14 de octubre – 2 de diciembre de 2014 (n=377).
Las tasas de ataque más altas se observaron en la parroquia de Póvoa de Santa Iria/Forte de Casa (60 por cada 10.000 habitantes) y disminuyeron a medida que se alejaba de esta parroquia (Fig. 2).
Mapa que muestra la tasa de incidencia de la enfermedad del Legionario por lugar de residencia (parroquia), Vila Franca de Xira, Portugal.
hubo 252 casos confirmados en los hombres (66%). La mediana de edad fue de 59 años, la tasa de ataques fue mayor en los hombres y aumentó con la edad en ambos sexos (25,1 por 10.000 hombres de 20 a 64 años frente a 37,9 por 10.000 hombres de más de 65 años) y en las mujeres (9,0 por 10.000 mujeres de 20 a 64 años frente a 26,1 casos por 10.000 mujeres de más de 65 años).
Doscientos ocho (55%) casos confirmados también notificaron un aumento de la susceptibilidad a la enfermedad, más comúnmente debido al tabaquismo y a la enfermedad cardiorrespiratoria crónica.
Identificación de fuentes
Cuarenta y nueve fuentes posibles; nacionales, públicas, comerciales e industriales (5) se identificaron y se redujeron a cuatro fuentes potenciales tras la investigación ambiental. Las cuatro eran industrias con sistemas de refrigeración húmeda.
Tres de las cuatro fuentes potenciales informaron casos sospechosos entre empleados, nueve casos fueron confirmados.
Análisis microbiológico, fenotípico y caracterización genética
El laboratorio de referencia recibió 95 muestras ambientales de 49 fuentes posibles, de las cuales se aislaron 8 cultivos positivos de L. pneumophila. Estas muestras se originaron en cuatro industrias con sistemas de refrigeración húmeda y un local comercial. Seis de los 8 cultivos positivos fueron L. pneumophila sg 2-15 (75%). L. pneumophila sg 1 se aisló de dos muestras ambientales tomadas de la misma torre de un sistema industrial, las concentraciones registradas fueron de 1,42×106ufc/l el 8 de noviembre y de 421ufc / l el 10 de noviembre. La tipificación secuencial de estos dos aislados ambientales identificó el nuevo genotipo ST1905.
La confirmación de laboratorio de los casos se realizó mediante pruebas de antígeno urinario para L. pneumophila sg 1 (92%); seroconversión (2%); PCR (3%) y título único a L. pneumophila (3%). se enviaron 152 muestras clínicas al laboratorio de referencia. De estos, 71 revelaron la presencia de L. pneumophila sg 1 con idéntico perfil de TBE ST1905.
37 aislados de L. pneumophila sg 1 se caracterizaron fenotípicamente, 35 aislados de muestras clínicas y dos de muestras ambientales. Los 37 aislados presentaron la misma característica fenotípica; subtipo Francia / Allentown y poseían el epítopo asociado a virulencia reconocido por el anticuerpo monoclonal MAb 3/1 (Fig. 3).
Procesamiento microbiológico y resultados de muestras clínicas.
Para confirmar la relación genética de los aislados de ST1905, se seleccionaron nominalmente 10 de los 71 aislados clínicos y un aislado positivo ambiental obtenido de la torre de enfriamiento industrial para la secuenciación del genoma completo. Pudimos usar alrededor de 99.8% de cada secuencia de borrador y no se encontraron diferencias de nucleótidos dentro de los 3,47 Mb comparados del genoma. El análisis filogenético que involucró múltiples aislados de L. pneumophila de todo el mundo reveló que el grupo ST1905 divergía claramente de la rama que incluía las cepas de L. pneumophila más estudiadas (serogrupos 1, 6 y 12)17-19 y estaba más estrechamente relacionado con la subsp de L. pneumophila. cepas de fraseri (serogrupo 4, 5 y 15).La confirmación de 20 WGS del perfil alélico ST1905 destacó un sesgo asociado con la extracción in silico de la secuencia alélica para el locus mompS. La cepa estudiada mostró copias mompS no coincidentes, lo que dificultó una atribución adecuada de ST si la TBE se determinaba exclusivamente in silico (Fig. 4).
Árbol filogenético que compara la secuencia genómica completa de aislados ambientales y clínicos.
Se registraron resultados meteorológicos, climáticos y de calidad del aire
Temperaturas superiores al promedio mensual del 18 de octubre al 1 de noviembre (>20°C), con una inversión térmica nocturna persistente asociada a un viento predominante NE y NNE con una velocidad de 2-3 km/h. La última semana de octubre tuvo más del 80% de humedad relativa, con períodos superiores al 90%. Octubre de 2014 fue el octubre más cálido en Portugal continental desde 1931, incluyendo una ola de calor de 11 días durante el período del 17 al 27 de octubre. Del 19 de octubre al 1 de noviembre, se registró en la estación local de calidad del aire el triple del nivel recomendado de partículas (PM10) y los valores semanales más altos de 2014, debido a un fuerte episodio de polvo de Sahara transportado a Portugal continental.
Evaluación del período de exposición
Los modelos de cálculo retrospectivo más adecuados sugirieron un crecimiento logístico de la exposición ambiental, con la mayor intensidad entre el 16 de octubre y el 4 de noviembre (Fig. 1).
Resultados del análisis de proximidad de fuente
Cuando se realizó el análisis de proximidad de fuente, hubo 365 casos confirmados, de los cuales 328 (90%) estaban georreferenciados a menos de 10 km de una de las cuatro fuentes potenciales (Fig. 5).
Enfermedad del legionario cerca de cuatro industrias con sistemas de refrigeración húmeda por distancia de residencia de la torre(s).
Las cuatro fuentes potenciales demostraron una disminución significativa del riesgo de enfermedad con el aumento de la distancia (agrupamiento) en el cuadrante SW. El agrupamiento más alto (ST157, p
0,001) se observó en el cuadrante SW de la industria 1. También se observaron agrupaciones con la industria 2 (ST 117, p0.001), la industria 3 (ST 126, p0.001) y la industria 4 (ST 66.1, p0.001). El riesgo de enfermedad disminuyó consistentemente con el aumento de la distancia de la fuente sin evidencia de picos o valles en este cuadrante. No se observaron aglomeraciones en los cuadrantes SE de ninguna industria, un área que comprendía en gran parte el río. Las industrias 1 y 2 demostraron un menor grado de agrupamiento en el cuadrante NE (ST 5, p=0,01 y ST 4,2, p=0,01, respectivamente). La agrupación también se demostró en el cuadrante NO de la industria 1 (ST 3,9, p=0,01).Discusión
Identificamos cuatro industrias con sistema de enfriamiento húmedo como las fuentes más probables del segundo brote más grande de enfermedad del Legionario registrado con 403 casos y 14 muertes. Concentraciones elevadas de L. pneumophila sg 1 ST1905 demostrando el subgrupo virulento MAb 3-1 se identificó en las torres de una industria. Usando SBT y WGS, pudimos confirmar la relación genética de las cepas clínicas y ambientales asociadas al brote. Los únicos aislados positivos para L. pneumophila sg 1, fueron obtenidos de la torre de enfriamiento de una industria. Concentraciones similares de L. pneumophila se han aislado en otras torres de enfriamiento asociadas con brotes.5 Es probable, aunque no probado, que la contaminación cruzada de las cuatro torres cercanas contribuyó a la magnitud del brote y se ha descrito anteriormente.21
Las temperaturas inusualmente cálidas registradas durante octubre de 2014 apoyaron la proliferación de especies de Legionelas en los sistemas de torres de enfriamiento.22 Las altas concentraciones de PM10 podrían haber actuado como núcleos de concentración de nubes facilitando la formación de aerosoles. La distribución y el gran número de casos se explican por el viento NE, la elevada humedad relativa y la inversión térmica observadas durante el período de liberación estimado, además de la larguidad23 y el aumento de la virulencia24 de una bacteria con epítopo MAb3/1.
El brote se produjo en una zona densamente poblada cercana a la capital de Portugal, que contenía rutas de cercanías muy utilizadas procedentes de zonas suburbanas. Es probable que el número real de personas expuestas haya sido mucho mayor que el de la población residente. Es posible que las pruebas de diagnóstico estándar no detecten todos los casos.3 Las cifras presentadas no contienen casos de fiebre de Pontiac ni casos sospechosos que dieron negativo y, por lo tanto, probablemente subestimen la morbilidad experimentada por la comunidad y el impacto en los servicios de salud locales. En cambio, debido a la presencia de la notificación electrónica de defunción en Portugal, fue posible garantizar que la información sobre si un caso había fallecido estaba completa. La letalidad observada (3,5% de todos los casos) fue inferior al 6% que se suele observar en los brotes asociados con torres y sistemas de enfriamiento.8 La cepa causante del brote se agrupó filogenéticamente aparte de las cepas de L. pneumophila sg 1 asociadas al brote más estudiadas (Lp Philadelphia-1, Lp Paris, Lp Lens, Lp Corby y Lp 2300/99 Alcoy). Se encontró que estaba estrechamente relacionado con L. pneumophila subsp. cepas de fraseri de serogrupos distintos de sg 1. La cepa estudiada alberga una región genómica exclusiva de ∼38 kb en comparación con la siguiente cepa más filogenéticamente relacionada. Se encontró que esta región estaba intacta y muy similar (BLASTn, cobertura 100%, identidad 99%, valor E 0,0) solo en una cepa (ATCC 33761=DSM 21215) de L. robledales, una especie que rara vez causa la enfermedad del Legionario.25 Explicaríamos la baja letalidad observada en términos de diagnóstico precoz y tratamiento adecuado y oportuno, si los rasgos únicos de la cepa asociada al brote subyacen a características importantes de letalidad sigue en estudio.
El análisis de proximidad de la fuente estimó el número esperado de casos de la población residente, lo que probablemente llevó a una subestimación de la exposición. Razonamos que la información residencial se recopilaba sistemáticamente, a diferencia del historial de desplazamiento, también las condiciones para la propagación horizontal de aerosoles eran más pronunciadas por la noche, cuando la mayoría de los residentes habrían estado en sus hogares. Un enfoque más sólido tendría que realizar el análisis como parte de un estudio de casos y controles, que también podría incluir exposiciones en no residentes. Aunque inicialmente se discutió, no procedimos con un estudio de casos y controles debido a limitaciones de recursos y tiempo. La proximidad geográfica cercana de las torres significaba que había superposición de algunas de las áreas de estudio, lo que hacía posible, pero improbable, que una fuente cercana pudiera llevar a la presencia de una relación de disminución de distancia para otra fuente. La comparación de la distribución geoespacial de los casos con el modelado de penachos de aerosoles podría ser útil para evaluar el impacto de fuentes cercanas entre sí.
Este brote fue el segundo brote más grande de enfermedad del Legionario registrado hasta la fecha y se suma al conjunto de pruebas sobre el impacto de las condiciones climáticas y los fenotipos bacterianos en los brotes comunitarios de enfermedad del Legionario asociados a torres de enfriamiento.
Conflictos de intereses
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.