typy Buněk v Komodo dragon krev
vzorek krve byl získán z Komodo drak jménem Tujah v Saint Augustine Alligator Farm Zoological Park v souladu s požadovanými bezpečnostními a regulačními postupy, a s odpovídající schválení. V době odběru, jsme se zajímali o sběr oba genomické DNA pro sekvenování stejně jako mRNA vytvořit cDNA knihovny pro usnadnění naší proteomic studií. U ptáků je známo, že heterofily (bílé krvinky) exprimují více antimikrobiálních peptidů . Antimikrobiální peptidy identifikované z kuřecích heterofilů vykazují významné antimikrobiální a hostitelské imunomodulační aktivity . Proto po získání počáteční vzorek čerstvé Komodo dragon krev, smíme bílé krvinky usadit se z krve a shromažďují je, protože jsou pravděpodobně zapojeny s antimikrobiální peptid výraz. Shromážděné Komodo dragon bílé krvinky pak byly rozděleny rovnoměrně, s půl zpracovávány pro izolaci genomické DNA v přípravě na sekvenování a knihovna generace, a druhá polovina vyhrazena pro mRNA extrakce pro naše proteomic studií.
poté jsme provedli nátěry a identifikovali různé typy buněk, které jsme pozorovali. Identifikace imunitních buněk v Komodské Dračí krvi je náročná kvůli omezené publikované literatuře pro referenci. Různé typy buněk, které byly pozorovány v krevních nátěrech obarvených Wrightem, jsou znázorněny na obr. 2. Tyto buňky jsme identifikovali na základě podobnosti s imunitními buňkami, které jsme dříve identifikovali v americké aligátorské krvi . Zajímavé byly velké a protáhlé jaderné červené krvinky tohoto plazů. Kromě toho jsme byli schopni identifikovat heterophils (podobné granulocyty), pravděpodobný zdroj cathelicidin peptidy, stejně jako monocytů a lymfocytů buněk.
Komodo dragon červené krvinky a imunitní buňky. Krevní buňky z Komodo dragon byly vizualizovány Wright stain a zobrazen na 40x. Mobilní typy jsou označeny jako: A jaderných červených krvinek, B, monocytů, lymfocytů C., a D. heterophil
druhý vzorek Komodo dragon krev byla později shromažďovány a zpracovávány pro genomické DNA extrakce pomocí Rybiny Genomika pro další sekvenování. Vědci z Dovetail Genomics neoddělili bílé krvinky a místo toho extrahovali DNA z buněk peletovaných přímo z plné krve.
sestavení a anotace genomu varan komodský
předchozí analýzy erytrocytů varan komodský pomocí průtokové cytometrie odhadly velikost genomu na přibližně 1,93 Gb . Pomocí hlubokého sekvenování Illumina a rybinových přístupů jsme získali návrh sestavy genomu, který byl 1,60 Gb velký, podobný velikosti genomu ještěrky a. carolinensis, který je 1,78 Gb . Návrh sestavy obsahuje 67,605 lešení s N50 23,2 Mb (Tabulka 1). Celkem 17,213 geny byly předpověděl, a 16,757 (97.35%) z nich byly komentovaný. Odhady úplnosti u CEGMA byly 56% („úplné“) a 94% („částečné“). Odhadované procento opakování v genomu je 35,05% , přičemž většina jsou čáry (38,4%) a SINEs (5,56%) (další soubor 1: obr. S1 & další soubor 2: Tabulka S1). Genomová data budou k dispozici v NCBI s raw sekvenční čte uloženy v Pořadí Číst Archiv (#SRP161190), a genom montáž na DDBJ/ENA/GenBank pod přistoupení #VEXN00000000. Montážní verze popsaná v tomto článku je vexn01000000.
Identifikace potenciální přirozené imunity a antimikrobiální peptid geny
Vrozené imunity u plazů je kritickým aspektem jejich evoluční úspěch, ale je to stále špatně chápána v těchto zvířat. Vrozená imunita je definována jako ty aspekty imunity, které nejsou protilátkami a ne T-buňkami. Vrozený imunitní reakce na invazi patogenů může zahrnovat expresi cytokinů, aktivace a náboru makrofágů, leukocytů a dalších bílých krvinek; a exprese antimikrobiálních peptidů, jako jsou defensiny a cathelicidins .
v této práci jsme použili genomický přístup k identifikaci vrozených imunitních genů v genomu komodského draka. Máme sekvenován Komodo genomu a zkoumal to pro geny a shluky důležité vrozenou imunitu antimikrobiální peptid genů (β-defensiny, ovodefensins a cathelicidins), které jsou pravděpodobně zapojeny ve výrazech přirozené imunity v této obří ještěrka.
β-Defensin a souvisejících genů v Komodo genomu
Defensiny jsou jedním z příkladů disulfid-stabilizované antimikrobiální peptidy, s β-defensiny být jednoznačně obratlovců rodiny disulfid-stabilizované, kationtové antimikrobiální peptidy podílející se na rezistenci k mikrobiální kolonizaci na epiteliální povrchy . Β-defensin peptidy jsou definovány charakteristické šest-cystein motiv s konzervovaným cysteinu rozteč (C–X6–C–X (3-5)–C–X (8-10)–C–X6–CC) a spojeny disulfid lepení vzor (Cys1-Cys5, Cys2-Cys4 a Cys3-Cys6); nicméně, rozdíly v počtu a mezery mezi zbytky cysteinu byla pozorována. Stejně jako u jiných kationtových antimikrobiálních peptidů vykazují β-defensiny obvykle čistý pozitivní (kationtový, bazický) náboj.
Jeden z prvních rozsáhlé zprávy o in vivo roli pro β-defensin peptid výraz u plazů je indukovatelnou expresi β-defensiny ve zraněný anole ještěrů (Anolis carolinensis) . Plaz neutrofilů se zdají mít granule, které obsahují jak cathelicidin-jako peptidy, stejně jako β-defensin peptidy. peptidy podobné β-defensinu se také nacházejí ve vejcích plazů . To je dobře-známo, že některé druhy ještěrky mohou ztratit jejich ocasy jako metoda predátorem uniknout, a že tyto ocasy, pak regenerovat z rány bez zánětu nebo infekce. β-defensinové peptidy jsou exprimovány jak v azurofilních granulocytech v lůžku rány, tak v přidruženém epitelu a jsou pozorovány ve fagosomech obsahujících degradované bakterie. Tam je zřetelný nedostatek zánět v ráně, která je spojena s regenerací, a dva β-defensiny zejména jsou vyjádřeny na vysoké úrovni při hojení tkání Celkově, zdá se, že významnou roli pro β-defensiny v hojení ran a regenerace v anole ještěrka .
β-defensinové geny byly obecně pozorovány v shlucích v genomech obratlovců . U lidí bylo identifikováno až 33 β-defensinových genů v pěti klastrech . V poslední době, analýzy genomů několika druhů ptáků, včetně kachny, zebra finch a kuře bylo zjištěno, že genom každého druhu obsahuje β-defensin clusteru . Β-defensin-jako gene cluster byl nedávno identifikován v anole ještěr (Prickett, M. D., nepublikované práce v pokroku), která je úzce souvisí s Komodo dragon . Zajímavé je, že cathepsin B gen (SBC) byl identifikován jako silný marker β-defensin klastrů u lidí, myší a kuřat . Proto jsme zkoumali Komodo genomu pro cathepsin B gen (CTSB) jako potenciální marker pro pomoc při identifikaci β-defensin cluster(y) přílohy.
Přes tyto analýzy jsme identifikovali celkem 66 potenciál β-defensin genů v Komodo dragon genomu, z nichž 18 jsou myšlenka být Komodo dragon-specifické β-defensin genů (Tabulka 2). Β-defensin geny identifikovány z Komodo dragon genomu vykazují variace v cystein mezery, gen, velikost, počet zbytky cysteinu, které tvoří β-defensin domény, stejně jako počet β-defensin domén. S ohledem na zachovaných cysteinu mezery, a to zejména na konci (C–X6–C–X (3-5)–C–X (8-10)–C–X6–CC), jsme zjistili značné variability v naší analýze β-defensin genů v Komodo dragon genomu, ve které pět Komodo dragon β-defensin geny mají sedm umístěn mezi poslední cysteines, 16 šest reziduí mezi poslední cysteines, 42 pět reziduí mezi poslední cysteines, a tři Komodo dragon β-defensin geny vykazují složitější cystein-zbytky řádkování vzory (Tabulka 2).
Jako s ptáky a jinými plazi, většina Komodo dragon defensin geny se zdají umístěny ve dvou samostatných klastrů ve stejné syntenic blok (Obr. 3). Jeden cluster je β-ovodefensin clusteru lemován na jednom konci genu pro XK, Kell krevní skupiny komplexu podjednotky související s rodinou, členských 6 (XKR6) a na druhém konci genu pro Myotubularin related protein 9 (MTMR9). Na intercluster regionu cca 400,000 bp obsahuje geny pro Rodiny s sekvenční podobnost 167, člen (FAM167A); BLK proto-onkogenu, Src rodina tyrosin kinázy (BLK); Farnesyl-difosfát farnesyl transferázy 1 (FDFT1); a SBC (cathepsin B), což je doprovodná gen pro β-defensin clusteru (Obr. 3). U ptáků, želv a krokodýlů, druhý konec β-defensin clusteru následuje gen pro Translokaci asociovaný membránový protein 2 (TRAM2). Stejně jako je tomu u všech ostatních squamate (ještěrky a hadi) genomy dotázaných, boční genu pro konec β-defensin clusteru nemůže být s konečnou platností stanovena v současné době, jak tam jsou žádné squamate genomů s neporušenou klastrů k dispozici.
genové klastry β-defensinu. Lešení místech určených Komodo dragon defensin a ovodefensin geny, zvýraznění defensin a ovodefensin klastrů v Komodo dragon genomu
konec clusteru mohl být lemován XPO1 nebo TRAM2 nebo ani jedno. Dva ze tří genů nalezených na lešení 45 s TRAM2 (VkBD80a, VkBD80b) jsou téměř identické a potenciálně jsou výsledkem montážního artefaktu. Geny jsou orthologs pro konečné genu v influenzy, želví a krokodýlí β-defensin klastrů. Anole ortholog pro tento gen je izolován a není spojen s TRAM2, XPO1 ani jinými β-defensiny a v blízkosti anole TRAM2 nejsou žádné β-defensiny. Dva ze sedmi genů spojených s XPO1 mít orthologs s jedním z pěti anole geny spojené s XPO1, ale to nemůže být stanovena buď druhu, pokud jsou součástí zbytku β-defensin clusteru nebo část další clusteru. Had orthologs jsou spojeny s TRAM2, ale nejsou součástí clusteru.
strukturální diverzita
rozmanitost lze pozorovat ve variacích struktury β-defensinové domény. Obvykle se β-defensin skládá z 2-3 exonů: signálního peptidu, exonu s propiece a β-defensinové domény se šesti cysteiny a v některých případech krátkého třetího exonu. Variace v počtu β-defensin domén, exon velikost, exon číslo, atypické rozteče cysteines, a/nebo počet cysteines v β-defensin domény lze nalézt ve všech plazů dotazovaných (nepublikované). Existují tři β-defensiny s dvěma defensin domén (VkBD7, VkBD34, a VkBD43) a jeden s třemi defensin domén (VkBD39). Komodo dragon β-defensin geny VkBD12, VkBD13, a VkBD14 a jejich orthologs v anolisů mají atypicky velké exons. Skupina β-defenzinů mezi VkBD16 a VkBD21 má také atypicky velké exony. Atypické odstupy mezi zbytky cysteinu se vyskytuje ve třech β-defensiny, VkBD20 (1-3-9-7), VkBD57 (3-4-8-5), a VkBD79 (3-10-16-6). V β-defensinové doméně jsou čtyři β-defensiny s dalšími cysteinovými zbytky: VkBD6 s 10 cystein zbytky, a skupina tří β-defensiny, VkBD16, VkBD17, a VkBD18, s osmi zbytky cysteinu.
dva β-defensin domény VkBD7 jsou homologní k jedné β-defensin domény VkBD8 s orthologs v dalších druhů Squamata. V anole ještěrka A. carolinensis existují dva orthologs, LzBD6 s jedním β-defensin domény a non-cluster LzBD82 s dvěma β-defensin domén. Ortologové v hadech (SnBD5 a SnBD6) mají jednu β-defensinovou doménu. VkBD34 je ortolog LzBD39 v anolech a SnBD15 v hadech. VkBD39 a VkBD43 se skládají ze tří a dvou homologních β-defensin domény, respektive, které jsou homologní k třetí exons z LzBD52, LzBD53, a LzBD55, z nichž všechny mají dva non-homologní β-defensin domén. VkBD40 s jedním β-defensin doména homologní k druhé exons z LzBD52, LzBD53, LzBD54 (s jedním defensin domény), a LzBD55.
zvýšení počtu cysteines v β-defensin domény výsledků v případně tvořit další disulfidovými můstky. Příklady této variace lze nalézt v psittacinu β-defensinu, Psittaciforme AvBD12 . Β-defensin domény VkBD6 zdá se skládají z 10 cysteines, z nichž čtyři jsou součástí rozšíření po typické β-defensin domény s další spárované cystein (C-X6-C-X4-C-X9-C-X6-CC-X7-C-X7-CC-X5-C). Skupina β-defenzinů Komodo VkBD16,VkBD17 a VkBD18 má kromě atypického rozestupu cysteinu také osm cysteinů v typickém počtu reziduí. Β-defensin po této skupině, VkBD19, je paralog z těchto tří genů; nicméně, β-defensin doména obsahuje více typické šest zbytky cysteinu.
genové struktury těchto Komodo β-defensin geny podléhají potvrzení s podklady. Existuje řada atypických konstrukčních prvků v anole ještěrky včetně dalších non β-defensin domény exons nebo větší exons.
Analýzy peptidové sekvence kódovány pomocí nově identifikovaných Komodo dragon β-defensin genů ukázal, že většina (53 out of 66) z nich se předpokládá, že mají kladný náboj ve fyziologických podmínek, jak je typické pro tuto třídu antimikrobiální peptid (Tabulka 3). Nicméně, je pozoruhodné, že čtyři peptidy (VkBD10, VkBD28, VkBD30 a VkBD34) předpokládá se, že se slabě kationaktivní nebo neutrální (+ 0.5–0) při pH 7, zatímco devět peptidy (VkBD3, VkBD4, VkBD11, VkBD19, VkBD23, VkBD26, VkBD35, VkBD36 a VkBD37) předpokládá se, že se slabě až silně aniontové. Tyto nálezy naznačují, zatímco tyto peptidy vykazují kanonické β-defensin strukturální vlastnosti a jsou umístěny v β-defensin genové shluky, jeden nebo více z těchto genů nemusí kódovat pro β-defensin-jako peptidy nebo kanonické β-defensiny, protože β-defensiny jsou obvykle kationty a jejich pozitivní náboj přispívá k jejich antimikrobiální aktivitu.
Identifikace Komodo dragon ovodefensin geny
Ovodefensin geny byly nalezeny ve více ptáků a plazů , s výrazem nachází v vaječný bílek a jiných tkání. Ovodefensins včetně kuřecí peptid gallin (Gallus gallus OvoDA1) bylo prokázáno, že mají antimikrobiální aktivitu proti Gram-negativní E. coli a Gram-pozitivní S. aureus. Předpokládané β-ovodefensiny se nacházejí v shluku ve stejném syntenickém bloku jako β-defensinová shluk u ptáků a plazů. Tam byly 19 β-ovodefensins nalezen v A. carolinensis (jeden s osmi cystein, β-defensin domény) a pět hadů (čtyři s osmi cystein, β-defensin domény) (Prickett, M. D., nepublikované práce v pokroku). Klastr Varan komodský se skládá ze šesti β-ovodefensinů (tabulky 4 a 5). Dva z nich mohou být specifické pro varan komodský; VkOVOD1, což je pseudois ortholog SnOVOD1 kromě prvního β-ovodefensinu u želv a krokodýlů. Defensinové domény VkOVOD3, VkOVOD4 a VkOVOD6 se skládají z osmi cysteinů, ortologů SnOVOD2, SnOVOD3 a SnOVOD5. VkOVOD4 a VkOVOD6 jsou ortologové LzOVOD14.
Identifikace Komodo dragon cathelicidin geny
Cathelcidin peptid geny byly nedávno identifikovány v plazy prostřednictvím genomika přístupy . U ptáků , hadů a ještěrky anole bylo identifikováno několik peptidových genů katelicidinu . Uvolňování funkčních katelicidinových antimikrobiálních peptidů bylo pozorováno z kuřecích heterofilů, což naznačuje, že zdrojem těchto peptidů mohou být také plazí heterofily . Alibardi a kol. identifikovali katelicidinové peptidy exprimované v tkáních ještěrek, včetně spojených s heterofily . Předpokládá se, že antimikrobiální peptidy katelicidinu hrají klíčovou roli při vrozené imunitě u jiných zvířat, a proto pravděpodobně hrají tuto roli také u Varan komodského.
u anole ještěrek je klastr genu katelicidinu, který se skládá ze 4 genů, uspořádán následovně: < FASTK> klastr katelicidinu <KLHL18>. Hledali jsme podobný katelicidinový shluk v genomu Varan komodský. Vyhledávání Komodo dragon genomu pro cathelicidin-jako geny, odhalila shluk tří genů, které mají „cathelin-like domain“, což je první požadavek cathelicidin genu, který se nachází na jednom konci saffold 84. Tato oblast lešení 84 má však problémy s montáží s mezerami, izolovanými exony a duplikacemi. Identifikované geny komodského draka katelicidinu byly pojmenovány podle jejich anole ortologů. Dva katelicidiny Varan komodský (Katelicidin2 a Katelicidin4. 1) jsou v sekcích bez problémů s montáží. Naopak, Cathlicidin4.2 byl konstruován pomocí různých exonů 1-3 a ztracená exon 4 vytvořit kompletní gen, který je paralogní k Cathelicidin4.1. Protože se shluk nachází na jednom konci lešení, mohou existovat další neidentifikované katelicidiny, které nejsou zachyceny v této sestavě.
společným znakem katelicidinových antimikrobiálních peptidových genových sekvencí je, že N-terminální katelinová doména kóduje alespoň 4 cysteiny. V naší studii z krokodýlí a hadí cathelicidins jsme také poznamenat, že obvykle po posledním cystein, tři-zbytky vzor skládající se z VRR nebo podobné sekvence bezprostředně předchází předpověděl C-terminální kationické antimikrobiální peptidy . Další požadavky na antimikrobiální peptid cathelicidin genové sekvence jsou, že to kóduje pro net-pozitivní nabitý peptid v C-terminální oblasti, je obvykle kódovány ve čtvrtém exonu, a to je obvykle přibližně 35 aa délka (v rozmezí 25-37) . Protože přirozeně se vyskytující proteáza zodpovědná za štěpení a uvolňování funkčních antimikrobiálních peptidů není známa, predikce přesného místa štěpení je obtížná. Jak je vidět v tabulce 6, jsou uvedeny predikované aminokyselinové sekvence pro každého z identifikovaných kandidátů na Gen Komodo dragon katelicidin. Při analýze každé sekvence jsme provedli předpovědi a závěry o tom, zda každý potenciální Gen katelicidinu může kódovat antimikrobiální peptid.
To může být vidět, že předpokládaná N-terminal protein sekvence Cathelicidin2_VARKO (VK-CATH2) obsahuje čtyři cysteines (zdůraznila, Tabulka 6). Nicméně, není zřejmé, „VRR“ nebo podobné sekvence v ~ 10 aminokyselin po posledním cysteinu, jak jsme viděli v aligátora a související cathelicidin sekvence . Kromě toho, analýza 35 C-koncových aminokyselin odhaluje předpověděl, peptidová sekvence, chybí kladný náboj. Z těchto důvodů předpovídáme, že sekvence genu Katelicidin2_varko nekóduje aktivní antimikrobiální peptid katelicidinu na jeho c-konci (Tabulka 7).
Pro identifikované Cathelicidin4.1_VARKO gen, předpokládané cathelin-doména obsahuje potřebné čtyři cystein zbytky (Tabulka 6), a sekvence „VTR“ je přítomen do 10 aminokyselin z posledních cystein, podobný „VRR“ sekvence v alligator cathelicidin gen . 33-aa C-terminální peptid v návaznosti na „VTR“ sekvence se předpokládá net + 12 náboj při fyziologickém pH, a velká část sekvence, předpokládá se, spirálové , což je v souladu s cathelicidins. Většina známých katelicidinů obsahuje segmenty s významnou spirálovou strukturou . Nakonec analýza sekvence pomocí databáze antimikrobiálních peptidů naznačuje, že peptid je potenciálně kationtový antimikrobiální peptid . Proto předpovídáme, že tento gen pravděpodobně kóduje aktivní katelicidinový antimikrobiální peptid, nazývaný VK-CATH4.1 (Tabulka 7).
kromě toho tento peptid vykazuje určitou homologii s jinými známými antimikrobiálními peptidy v databázi antimikrobiálních peptidů (tabulka 8). To ukazuje zejména vysoký stupeň sekvenční podobnosti k cathelicidin peptidů identifikovány z squamates, s příklady je uveden v Tabulce 8. To znamená, že předpokládané VK-CATH4.1 peptid má mnoho punc vlastnosti peptid cathelicidin a je silným kandidátem pro další studium. Tabulka 8 ukazuje zarovnání VK_CATH4. 1 se známými peptidy v databázi antimikrobiálních peptidů .
Pro identifikované Cathelicidin4.2_VARKO gen, předpokládané cathelin domény obsahuje potřebné čtyři cystein zbytky (Tabulka 6). Jak bylo uvedeno v Cathelicidin4.1_VARKO genové sekvence „VTR“ je přítomen do 10 aminokyselin čtvrté cysteinu, a bezprostředně předchází C-terminální segment, který kóduje pro 30-aa peptid, že se předpokládá, že antimikrobiální . Sekvence aminokyselin C-terminální peptid, předpokládá se, že mají net + 10 náboj při fyziologickém pH, a to ukazuje, lišily stupněm homologie k další známé antimikrobiální peptidy Antimikrobiální Peptid Databáze . Tak, jako VK-CATH4.1, tento kandidát peptid vykazuje také mnoho punc vlastnosti spojené s cathelicidin peptidy, a je druhým silným kandidátem pro další studium. Tabulka 8 ukazuje homologii a zarovnání VK-CATH4. 2 se známými peptidy z databáze antimikrobiálních peptidů. Konečně, sekvence genu kódující funkční peptid VK-CATH4.2 je nalézt na exon 4, což je typické umístění aktivní peptid cathelicidin. Tento exon kóduje peptidovou sekvenci LDRVTRRRRRFFQKAKRFVKRHGVSIAVGAYRIIG.
předpokládané peptid VK-CATH4.2 je vysoce homologní s peptidy z jiných předpověděl cathelicidin geny, s podobnými předpověděl, C-koncových peptidů, z. A. carolinensis, G. japonicus, a P. bivittatus (Tabulka 8). Zbytky 2-27 VK-CATH4.2 jsou 65% identické a 80% podobné anole Cathelicidin-2 jako předpověděl C-terminální peptid (XP_008116755.1, aa 130-155). Zbytky 2-30 VK-CATH4.2 jsou 66% identické a 82% podobné gecko Cathelicidin-související předpověděl C-terminální peptid (XP_015277841.1, aa 129-151). Konečně, aa 2-24 VK-CATH4.2 57% identické a 73% podobné Cathelicidin související s OH-CATH-Jako předpověděl C-terminální peptid (XP_007445036.1, aa 129-151).