Zelltypen im Komodowaranenblut
Eine Blutprobe wurde von einem Komodowaran namens Tujah im Zoologischen Park Saint Augustine Alligator Farm gemäß den erforderlichen sicherheits- und behördlichen Verfahren und mit entsprechenden Genehmigungen entnommen. Zum Zeitpunkt der Sammlung waren wir daran interessiert, sowohl genomische DNA für die Sequenzierung als auch mRNA zu sammeln, um eine cDNA-Bibliothek zu generieren, um unsere proteomischen Studien zu erleichtern. Bei Vögeln ist bekannt, dass die Heterophilen (weißen Blutkörperchen) mehrere antimikrobielle Peptide exprimieren . Antimikrobielle Peptide, die aus Hühnerheterophilen identifiziert wurden, zeigen signifikante antimikrobielle und wirtsgerichtete immunmodulatorische Aktivitäten . Nachdem wir eine erste Probe von frischem Komodowaranenblut erhalten hatten, ließen wir die weißen Blutkörperchen sich aus dem Blut absetzen und sammelten sie, weil sie wahrscheinlich an der antimikrobiellen Peptidexpression beteiligt waren. Die gesammelten weißen Blutkörperchen des Komodowarans wurden dann gleichmäßig aufgeteilt, wobei die Hälfte zur Isolierung genomischer DNA zur Vorbereitung der Sequenzierung und Bibliothekserzeugung verarbeitet wurde und die andere Hälfte für die mRNA-Extraktion für unsere proteomischen Studien reserviert war.
Wir führten dann Abstriche durch und identifizierten die verschiedenen Zelltypen, die wir beobachteten. Die Identifizierung von Immunzellen im Blut von Komodowaranen ist aufgrund der begrenzten veröffentlichten Literatur als Referenz schwierig. Die verschiedenen Zelltypen, die in Wright-gefärbten Blutausstrichen beobachtet wurden, sind in Abb. 2. Wir identifizierten diese Zellen aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit den Immunzellen, die wir zuvor im Blut amerikanischer Alligatoren identifiziert hatten . Von Interesse waren die großen und länglichen kernhaltigen roten Blutkörperchen dieses Reptils. Darüber hinaus konnten wir Heterophile (ähnlich wie Granulozyten), eine wahrscheinliche Quelle für Cathelicidinpeptide, sowie Monozyten- und Lymphozytenzellen identifizieren.
Komodowaran rote Blutkörperchen und Immunzellen. Blutzellen von Komodowaran wurden durch Wright-Färbung sichtbar gemacht und bei 40x abgebildet. Zelltypen werden identifiziert als: A. nukleierte rote Blutkörperchen, B. Monozyten, C. Lymphozyten und D. heterophil
Eine zweite Probe von Komodo-Drachenblut wurde später gesammelt und für die genomische DNA-Extraktion von Dovetail Genomics für zusätzliche Sequenzierung verarbeitet. Die Forscher von Dovetail Genomics trennten keine weißen Blutkörperchen, sondern extrahierten DNA aus Zellen, die direkt aus Vollblut pelletiert wurden.
Assemblierung und Annotation des Komodowarangenoms
Frühere Analysen von Komodowaran-Erythrozyten mittels Durchflusszytometrie schätzten die Größe des Genoms auf etwa 1,93 GB . Mithilfe von Deep Illumina-Sequenzierungs- und Schwalbenschwanzansätzen erhielten wir einen Entwurf einer Genomassemblierung, die 1,60 GB groß war, ähnlich der Genomgröße des A. carolinensis-Eidechsengenoms von 1,78 GB . Der Baugruppenentwurf enthält 67.605 Gerüste mit N50 von 23,2 Mb (Tabelle 1). Insgesamt wurden 17.213 Gene vorhergesagt, von denen 16.757 (97,35%) kommentiert wurden. Vollständigkeitsschätzungen mit CEGMA betrugen 56% (‚vollständig‘) und 94% (‚teilweise‘). Der geschätzte Prozentsatz der Wiederholungen im Genom beträgt 35,05%, wobei die Mehrheit Linien (38,4%) und Sinus (5,56%) sind (Zusätzliche Datei 1: Abb. S1 & Zusätzliche Datei 2: Tabelle S1). Genomische Daten werden bei NCBI mit rohen Sequenzierungslesungen im Sequenzlesearchiv (# SRP161190) und der Genomassemblierung bei DDBJ / ENA / GenBank unter dem Namen #VEXN00000000 verfügbar sein. Die in diesem Dokument beschriebene Assemblyversion ist VEXN01000000.
Identifizierung potenzieller angeborener Immunität und antimikrobieller Peptidgene
Die angeborene Immunität bei Reptilien ist ein kritischer Aspekt ihres evolutionären Erfolgs, wird bei diesen Tieren jedoch nach wie vor wenig verstanden. Angeborene Immunität ist definiert als jene Aspekte der Immunität, die keine Antikörper und keine T-Zellen sind. Angeborene Immunantworten auf eindringende Krankheitserreger können die Expression von Zytokinen umfassen; die Aktivierung und Rekrutierung von Makrophagen, Leukozyten und anderen weißen Blutkörperchen; und die Expression antimikrobieller Peptide wie Defensine und Cathelicidine .
Wir haben in dieser Arbeit einen genomikbasierten Ansatz zur Identifizierung angeborener Immunitätsgene im Komodowarangenom gewählt. Wir haben das Komodo-Genom sequenziert und auf Gene und Cluster wichtiger antimikrobieller Peptidgene der angeborenen Immunität (β-Defensine, Ovodefensine und Cathelicidine) untersucht, die wahrscheinlich an der Expression der angeborenen Immunität in dieser Riesenechse beteiligt sind.
β-Defensin und verwandte Gene im Komodo-Genom
Defensine sind ein Beispiel für disulfidstabilisierte antimikrobielle Peptide, wobei β-Defensine eine einzigartige Wirbeltierfamilie von disulfidstabilisierten, kationischen antimikrobiellen Peptiden sind, die an der Resistenz gegen mikrobielle Besiedlung an Epitheloberflächen beteiligt sind . Die β-Defensinpeptide werden durch ein charakteristisches Sechs-Cysteinmotiv mit konserviertem Cysteinrestabstand (C–X6–C–X (3-5) –C–X (8-10) –C–X6–CC) und zugehörigem Disulfidbindungsmuster (Cys1-Cys5, Cys2-Cys4 und Cys3-Cys6) definiert; Es wurden jedoch Variationen in der Anzahl und im Abstand zwischen Cysteinresten beobachtet. Wie bei anderen kationischen antimikrobiellen Peptiden weisen β-Defensine typischerweise eine positive (kationische, basische) Nettoladung auf.
Einer der ersten umfangreichen Berichte über eine in vivo Rolle der β-Defensin-Peptid-Expression in Reptilien ist die induzierbare Expression von β-Defensinen in verwundeten Anole-Eidechsen (Anolis carolinensis) . Reptilien-Neutrophile scheinen Granulate zu haben, die sowohl Cathelicidin-ähnliche Peptide als auch β-Defensin-Peptide enthalten. β-Defensin-ähnliche Peptide finden sich auch in Reptilieneiern . Es ist bekannt, dass einige Eidechsenarten ihre Schwänze als Methode der Räuberflucht verlieren können und dass sich diese Schwänze dann ohne Entzündung oder Infektion von der Wundstelle regenerieren. β-Defensinpeptide werden sowohl innerhalb der azurophilen Granulozyten im Wundbett als auch im assoziierten Epithel exprimiert und in Phagosomen mit abgebauten Bakterien beobachtet. Es gibt einen deutlichen Mangel an Entzündung in der Wunde, die mit Regeneration verbunden ist, und insbesondere zwei β-Defensine werden in hohen Konzentrationen in den heilenden Geweben exprimiert Insgesamt scheint es eine signifikante Rolle für die β-Defensine bei der Wundheilung und Regeneration in der Anole-Eidechse zu geben .
Es wurde allgemein beobachtet, dass β-Defensin-Gene in Clustern innerhalb der Genome von Wirbeltieren vorkommen . Beim Menschen wurden bis zu 33 β-Defensin-Gene in fünf Clustern identifiziert . Kürzlich ergaben Analysen der Genome mehrerer Vogelarten, darunter Ente, Zebrafink und Huhn, dass das Genom jeder Art einen β-Defensin-Cluster enthielt . Ein β-Defensin-ähnlicher Gencluster wurde kürzlich in der Anole-Eidechse (Prickett, M.D., unveröffentlichte Arbeit in Arbeit) identifiziert, die eng mit dem Komodo-Drachen verwandt ist . Interessanterweise wurde das Cathepsin-B-Gen (CTSB) als starker Marker für β-Defensin-Cluster bei Menschen, Mäusen und Hühnern identifiziert . Daher untersuchten wir das Komodo-Genom auf das Cathepsin-B-Gen (CTSB) als potenziellen Marker, um die Identifizierung der β-Defensin-Cluster darin zu unterstützen.
Durch diese Analysen identifizierten wir insgesamt 66 potenzielle β-Defensin-Gene im Komodowaran-Genom, von denen 18 als Komodowaran-spezifische β-Defensin-Gene angesehen werden (Tabelle 2). Die aus dem Komodo-Drachengenom identifizierten β-Defensin-Gene zeigen Variationen im Cysteinabstand, in der Gengröße, in der Anzahl der Cysteinreste, die die β-Defensin-Domäne umfassen, sowie in der Anzahl der β-Defensin-Domänen. In Bezug auf den konservierten Cystein–Restabstand, insbesondere am Ende (C–X6–C–X (3-5) –C–X (8-10) –C–X6-CC), fanden wir eine beträchtliche Variabilität in unserer Analyse der β-Defensin-Gene im Komodo-Drachen-Genom, indem fünf Komodo-Drachen-β-Defensin-Gene sieben Reste zwischen den letzten Cysteinen, 16 haben sechs Reste zwischen den letzten Cysteinen, 42 haben fünf Reste zwischen den letzten Cysteinen und drei Komodo-Drachen-β- -Defensingene weisen komplexere Cystein-Rest-Abstandsmuster auf (Tabelle 2).
Wie bei Vögeln und anderen Reptilien scheint die Mehrheit der Komodowaran-Defensingene in zwei getrennten Clustern innerhalb desselben Syntenblocks zu liegen (Abb. 3). Ein Cluster ist ein β-Ovodefensin-Cluster, der an einem Ende vom Gen für XK, Kell blood group complex subunit-related family, member 6 (XKR6) und am anderen Ende vom Gen für Myotubularin related Protein 9 (MTMR9) flankiert wird. Die Interclusterregion von circa 400.000 bp umfasst die Gene für die Familie mit Sequenzähnlichkeit 167, Mitglied A (FAM167A); BLK-Proto-Onkogen, Src-Familientyrosinkinase (BLK); Farnesyl-Diphosphat-Farnesyltransferase 1 (FDFT1); und CTSB (Cathepsin B), das ein flankierendes Gen für den β-Defensin-Cluster ist (Abb. 3). Bei Vögeln, Schildkröten und Krokodilen folgt auf das andere Ende des β-Defensin-Clusters das Gen für das translokationsassoziierte Membranprotein 2 (TRAM2). Wie bei allen anderen untersuchten Squamat-Genomen (Eidechsen und Schlangen) kann das flankierende Gen für das Ende des β-Defensin-Clusters derzeit nicht definitiv bestimmt werden, da keine Squamat-Genome mit intakten Clustern verfügbar sind.
β-Defensin-Genfamiliencluster. Gerüstpositionen der identifizierten Komodowaran-Defensin- und Ovodefensin-Gene, Hervorhebung der Defensin- und Ovodefensin-Cluster im Komodowaran-Genom
Das Ende des Clusters könnte entweder von XPO1 oder XPO2 flankiert sein oder keines von beiden. Zwei der drei Gene, die auf Scaffold 45 mit TRAM2 gefunden wurden (VkBD80a, VkBD80b), sind nahezu identisch und möglicherweise das Ergebnis eines Assemblierungsartefakts. Die Gene sind Orthologe für das letzte Gen in den β-Defensin-Clustern von Vögeln, Schildkröten und Krokodilen. Das Anol-Ortholog für dieses Gen ist isoliert und nicht mit TRAM2, XPO1 oder anderen β-Defensinen assoziiert, und es gibt keine β-Defensine in der Nähe von Anole TRAM2. Zwei der sieben mit XPO1 assoziierten Gene weisen Orthologe mit einem der fünf mit XPO1 assoziierten Anol-Gene auf, es kann jedoch bei keiner Spezies bestimmt werden, ob diese Teil des restlichen β-Defensin-Clusters oder Teil eines zusätzlichen Clusters sind. Die Schlangenorthologen sind mit TRAM2 assoziiert, aber nicht Teil des Clusters.
Strukturelle Diversität
Diversität kann in Variationen in der Struktur der β-Defensin-Domäne gesehen werden. Typischerweise besteht ein β-Defensin aus 2-3 Exons: einem Signalpeptid, einem Exon mit der Propiece- und β-Defensindomäne mit sechs Cysteinen und in einigen Fällen einem kurzen dritten Exon. Variationen in der Anzahl der β-Defensin-Domänen, Exongröße, Exonzahl, atypischem Abstand der Cysteine und / oder der Anzahl der Cysteine in der β-Defensin-Domäne können bei allen untersuchten Reptilienarten gefunden werden (unveröffentlicht). Es gibt drei β-Defensine mit zwei Defensindomänen (VkBD7, VkBD34 und VkBD43) und eine mit drei Defensindomänen (VkBD39). Die Komodowaran β-Defensin Gene VkBD12, VkBD13 und VkBD14 und ihre Orthologen in Anolen haben atypisch große Exons. Die Gruppe der β-Defensine zwischen VkBD16 und VkBD21 weist ebenfalls atypisch große Exons auf. Ein atypischer Abstand zwischen Cysteinresten findet sich in drei β-Defensinen, VkBD20 (1-3-9-7), VkBD57 (3-4-8-5) und VkBD79 (3-10-16-6). Es gibt vier β-Defensine mit zusätzlichen Cysteinresten in der β-Defensindomäne: VkBD6 mit 10 Cysteinresten und eine Gruppe von drei β-Defensinen, VkBD16, VkBD17 und VkBD18 mit acht Cysteinresten.
Die beiden β-Defensindomänen von VkBD7 sind homolog zu der einen β-Defensindomäne von VkBD8 mit Orthologen in anderen Squamata-Arten. In der Anoleidechse A. carolinensis gibt es zwei Orthologe, LzBD6 mit einer β-Defensindomäne und die Nicht-Cluster-LzBD82 mit zwei β-Defensindomänen. Die Orthologen in Schlangen (SnBD5 und SnBD6) haben eine β-Defensin-Domäne. VkBD34 ist ein Ortholog von LzBD39 in Anolen und SnBD15 in Schlangen. VkBD39 und VkBD43 bestehen aus drei bzw. zwei homologen β-Defensindomänen, die homolog zu den dritten Exons von LzBD52, LzBD53 und LzBD55 sind, die alle zwei nicht homologe β-Defensindomänen aufweisen. VkBD40 mit einer β-Defensindomäne ist homolog zu den zweiten Exons von LzBD52, LzBD53, LzBD54 (mit einer Defensindomäne) und LzBD55.
Eine Erhöhung der Anzahl der Cysteine in der β-Defensindomäne führt zur Bildung zusätzlicher Disulfidbrücken. Beispiele für diese Variation finden sich im Psittacin β-Defensin, Psittaciforme AvBD12 . Die β-Defensin-Domäne von VkBD6 scheint aus 10 Cysteinen zu bestehen, von denen vier Teil einer Erweiterung nach einer typischen β-Defensin-Domäne mit einem zusätzlichen gepaarten Cystein (C-X6-C-X4-C-X9-C-X6-CC-X7-C-X7-CC-X5-C) sind. Die Gruppe der Komodo-β-Defensine VkBD16, VKBD17 und VKBD18 weist neben einem atypischen Cysteinabstand auch acht Cysteine innerhalb einer typischen Anzahl von Resten auf. Das dieser Gruppe folgende β-Defensin, VkBD19, ist ein Paralog dieser drei Gene; Die β-Defensindomäne enthält jedoch die typischeren sechs Cysteinreste.
Die Genstrukturen dieser Komodo-β-Defensin-Gene müssen durch Belege bestätigt werden. Es gibt eine Reihe von atypischen Strukturelementen in Anole-Eidechsen, einschließlich zusätzlicher Nicht-β-Defensin-Domänen-Exons oder größerer Exons.
Analysen der Peptidsequenzen, die von den neu identifizierten β-Defensin-Genen des Komodowarans kodiert wurden, ergaben, dass die Mehrheit (53 von 66) von ihnen unter physiologischen Bedingungen eine positive Nettoladung aufweist, wie dies für diese Klasse antimikrobieller Peptide typisch ist (Tabelle 3). Es ist jedoch bemerkenswert, dass vier Peptide (VkBD10, vkbd28, VKBD30 und VKBD34) bei pH 7 als schwach kationisch oder neutral (+ 0,5–0) vorhergesagt werden, während neun Peptide (vkbd3, vkbd4, vkbd11, VKBD19, vkbd23, VKBD26, vkbd35, vkbd36 und VKBD37) als schwach bis stark anionisch vorhergesagt werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass diese Peptide zwar kanonische β-Defensin-Strukturmerkmale aufweisen und sich in β-Defensin-Genclustern befinden, eines oder mehrere dieser Gene jedoch möglicherweise nicht für β-Defensin-ähnliche Peptide oder kanonische β-Defensine kodieren, da β-Defensine typischerweise kationisch sind und ihre positive Ladung zu ihrer antimikrobiellen Aktivität beiträgt.
Identifizierung von Komodowaran-Ovodefensin-Genen
Ovodefensin-Gene wurden in mehreren Vogel- und Reptilienarten gefunden , wobei die Expression in Eiweiß und anderen Geweben gefunden wurde. Es wurde gezeigt, dass Ovodefensine, einschließlich des Hühnerpeptids Gallin (Gallus gallus OvoDA1), eine antimikrobielle Aktivität gegen gramnegative E. coli und grampositive S. aureus aufweisen. Vermutliche β-Ovodefensine finden sich in einem Cluster im selben Syntenblock wie der β-Defensin-Cluster bei Vögeln und Reptilien. Es wurden 19 β-Ovodefensine in A. carolinensis (eines mit acht Cystein-β-Defensin-Domänen) und fünf in Schlangen (vier mit acht Cystein-β-Defensin-Domänen) gefunden (Prickett, M.D., unveröffentlichte Arbeit in Arbeit). Der Komodowaran-Cluster besteht aus sechs β-Ovodefensinen (Tabellen 4 und 5). Zwei davon können Komodowaranspezifisch sein; VkOVOD1, ein Pseudo, ist ein Ortholog von SnOVOD1 zusätzlich zum ersten β-Ovodefensin bei Schildkröten und Krokodilen. Die Defensindomänen VkOVOD3, VkOVOD4 und VkOVOD6 bestehen aus acht Cysteinen, Orthologen von SnOVOD2, SnOVOD3 und SnOVOD5. VkOVOD4 und VkOVOD6 sind Orthologen von LzOVOD14.
Identifizierung der Komodowaran Cathelicidin-Gene
Cathelcidin-Peptidgene wurden kürzlich in Reptilien durch genomische Ansätze identifiziert . Mehrere Cathelicidin-Peptidgene wurden bei Vögeln , Schlangen und der Anole-Eidechse identifiziert . Die Freisetzung von funktionellen Cathelicidin-antimikrobiellen Peptiden wurde von Hühnerheterophilen beobachtet, was darauf hindeutet, dass Reptilien-Heterophile auch eine Quelle dieser Peptide sein können . Alibardi et al. haben Cathelicidin-Peptide identifiziert, die in Anole-Eidechsengeweben exprimiert werden, einschließlich mit Heterophilen assoziiert . Es wird angenommen, dass Cathelicidin-antimikrobielle Peptide eine Schlüsselrolle bei der angeborenen Immunität anderer Tiere spielen und diese Rolle wahrscheinlich auch beim Komodo-Drachen spielen.
In Anole-Eidechsen ist der Cathelicidin-Gencluster, bestehend aus 4 Genen, wie folgt organisiert: <FASTK> Cathelicidin-Cluster <KLHL18>. Wir suchten nach einem ähnlichen Cathelicidin-Cluster im Komodowaran-Genom. Die Suche im Komodowarangenom nach Cathelicidin-ähnlichen Genen ergab eine Gruppe von drei Genen mit einer „Cathelin-ähnlichen Domäne“, die die erste Voraussetzung für ein Cathelicidin-Gen ist, das sich an einem Ende von Saffold 84 befindet. Dieser Bereich des Gerüsts 84 weist jedoch Montageprobleme mit Lücken, isolierten Exons und Duplikationen auf. Identifizierte Komodowaran Cathelicidin Gene wurden nach ihren Anole Orthologen benannt. Zwei der Komodowarane Cathelicidine (Cathelicidin2 und Cathelicidin4.1) sind in Abschnitten ohne Montageprobleme. Im Gegensatz dazu wurde Cathlicidin4.2 unter Verwendung eines vielfältigen Satzes von Exons 1-3 und eines verlegten Exons 4 konstruiert, um ein vollständiges Gen zu erzeugen, das zu Cathelicidin4.1 paralog ist. Da sich der Cluster an einem Ende des Gerüsts befindet, können zusätzliche nicht identifizierte Cathelicidine vorhanden sein, die in dieser Anordnung nicht erfasst werden.
Ein gemeinsames Merkmal von Cathelicidin-antimikrobiellen Peptid-Gensequenzen ist, dass die N-terminale Cathelin-Domäne für mindestens 4 Cysteine kodiert. In unserer Studie von Alligator- und Schlangenkathelicidinen stellten wir auch fest, dass typischerweise nach dem letzten Cystein ein Muster mit drei Rückständen, bestehend aus VRR oder einer ähnlichen Sequenz, unmittelbar vor dem vorhergesagten C-terminalen kationischen antimikrobiellen Peptid liegt . Zusätzliche Anforderungen an eine Cathelicidin-antimikrobielle Peptid-Gensequenz sind, dass sie für ein nettopositiv geladenes Peptid in der C-terminalen Region codiert, typischerweise durch das vierte Exon codiert wird und typischerweise ungefähr 35 aa lang ist (Bereich 25-37) . Da die natürlich vorkommende Protease, die für die Spaltung und Freisetzung der funktionellen antimikrobiellen Peptide verantwortlich ist, nicht bekannt ist, ist die Vorhersage der genauen Schnittstelle schwierig. Wie in Tabelle 6 zu sehen ist, sind die vorhergesagten Aminosäuresequenzen für jeden der identifizierten Komodowaran-Cathelicidin-Genkandidaten aufgeführt. Bei der Durchführung unserer Analyse jeder Sequenz haben wir Vorhersagen und Schlussfolgerungen darüber getroffen, ob jedes potenzielle Cathelicidin-Gen für ein antimikrobielles Peptid kodieren kann.
Man erkennt, dass die vorhergesagte N-terminale Proteinsequenz von Cathelicidin2_VARKO (VK-CATH2) vier Cysteine enthält (unterstrichen, Tabelle 6). Es gibt jedoch keine offensichtliche „VRR“ oder ähnliche Sequenz in den ~ 10 Aminosäuren nach dem letzten Cysteinrest, wie wir in den Alligator- und verwandten Cathelicidin-Sequenzen gesehen haben . Darüber hinaus zeigt die Analyse der 35 C-terminalen Aminosäuren eine vorhergesagte Peptidsequenz ohne positive Nettoladung. Aus diesen Gründen sagen wir voraus, dass die Cathelicidin2_VARKO-Gensequenz an ihrem C-Terminus nicht für ein aktives Cathelicidin2-Peptid kodiert (Tabelle 7).
Für das identifizierte Cathelicidin4.1_VARKO-Gen enthält die vorhergesagte Cathelin-Domäne die erforderlichen vier Cysteinreste (Tabelle 6), und die Sequenz „VTR“ ist innerhalb von 10 Aminosäuren des letzten Cysteins vorhanden, ähnlich der „VRR“ -Sequenz im vorherigen Cathelicidin-Gen. Das 33-aa-C-terminale Peptid, das der „VTR“ -Sequenz folgt, wird bei physiologischem pH-Wert voraussichtlich eine Nettoladung von + 12 aufweisen, und ein großer Teil der Sequenz wird voraussichtlich helikal sein , was mit Cathelicidinen übereinstimmt. Die Mehrheit der bekannten Cathelicidine enthält Segmente mit signifikanter helikaler Struktur . Schließlich zeigt die Analyse der Sequenz unter Verwendung der antimikrobiellen Peptiddatenbank, dass das Peptid potentiell ein kationisches antimikrobielles Peptid ist. Daher sagen wir voraus, dass dieses Gen wahrscheinlich für ein aktives antimikrobielles Cathelicidin-Peptid namens VK-CATH4.1 kodiert (Tabelle 7).
Darüber hinaus zeigt dieses Peptid eine gewisse Homologie zu anderen bekannten antimikrobiellen Peptiden in der antimikrobiellen Peptiddatenbank (Tabelle 8). Es zeigt eine besonders hohe Sequenzähnlichkeit zu Cathelicidinpeptiden, die aus Squamaten identifiziert wurden, wobei Beispiele in Tabelle 8 enthalten sind. Somit weist das vorhergesagte VK-CATH4.1-Peptid viele der charakteristischen Eigenschaften eines Cathelicidin-Peptids auf und ist ein starker Kandidat für weitere Studien. Tabelle 8 zeigt das Alignment von VK_CATH4.1 mit bekannten Peptiden in der Antimicrobial Peptide Database.
Für das identifizierte Cathelicidin4.2_VARKO-Gen enthält die vorhergesagte Cathelindomäne die erforderlichen vier Cysteinreste (Tabelle 6). Wie im Cathelicidin4.1_VARKO-Gen festgestellt wurde, ist die Sequenz „VTR“ innerhalb von 10 Aminosäuren des vierten Cysteinrestes vorhanden und geht unmittelbar dem C-terminalen Segment voraus, das für ein 30-aa-Peptid codiert, von dem vorhergesagt wird, dass es antimikrobiell ist . Es wird vorhergesagt, dass die Aminosäuresequenz des C-terminalen Peptids bei physiologischem pH-Wert eine Nettoladung von + 10 aufweist, und es zeigt unterschiedliche Grade der Homologie zu anderen bekannten antimikrobiellen Peptiden in der antimikrobiellen Peptiddatenbank . So wie VK-CATH4.1, zeigt dieses Kandidatenpeptid auch viele der charakteristischen Eigenschaften, die mit Cathelicidinpeptiden verbunden sind, und ist ein zweiter starker Kandidat für weitere Studien. Tabelle 8 zeigt die Homologie und Alignment von VK-CATH4.2 mit bekannten Peptiden aus der Antimicrobial Peptide Database. Schließlich befindet sich die Gensequenz, die für das funktionelle Peptid VK-CATH4.2 kodiert, auf Exon 4, dem typischen Ort des aktiven Cathelicidinpeptids. Dieses Exon kodiert für die Peptidsequenz LDRVTRRRWRRFFQKAKRFVKRHGVSIAVGAYRIIG.
Das vorhergesagte Peptid VK-CATH4.2 ist hoch homolog zu Peptiden aus anderen vorhergesagten Cathelicidin-Genen mit ähnlichen vorhergesagten C-terminalen Peptiden aus A. carolinensis, G. japonicus und P. bivittatus (Tabelle 8). Rückstände 2-27 von VK-24.2 sind zu 65% identisch und zu 80% ähnlich dem Anol-Cathelicidin-2-ähnlichen, C-terminalen Peptid (XP_008116755.1, aa 130-155). Die Reste 2-30 von VK-CATH4.2 sind zu 66% identisch und zu 82% ähnlich wie das mit Gecko Cathelicidin verwandte vorhergesagte C-terminale Peptid (XP_015277841.1, aa 129-151). Schließlich sind aa 2-24 von VK-CATH4.2 zu 57% identisch und zu 73% ähnlich dem Cathelicidin-verwandten OH-CATH-Like-C-terminalen Peptid (XP_007445036.1, aa 129-151).