tipi di Cellule nel sangue di drago di Komodo
Un campione di sangue è stato ottenuto da un drago di Komodo denominato Tujah a Saint Augustine Alligator Farm Zoological Park, in conformità con i requisiti di sicurezza e di regolamentazione delle procedure e con le dovute approvazioni. Al momento della raccolta, eravamo interessati a raccogliere sia il DNA genomico per il sequenziamento sia l’mRNA per generare una libreria di cDNA per facilitare i nostri studi proteomici. Negli uccelli, gli eterofili (globuli bianchi) sono noti per esprimere più peptidi antimicrobici . I peptidi antimicrobici identificati dagli eterofili di pollo mostrano significative attività immunomodulatorie antimicrobiche e dirette all’ospite . Di conseguenza, dopo aver ottenuto un campione iniziale di sangue fresco di drago di Komodo, abbiamo permesso ai globuli bianchi di depositarsi fuori dal sangue e li abbiamo raccolti perché probabilmente erano coinvolti nell’espressione del peptide antimicrobico. I globuli bianchi del drago di Komodo raccolti sono stati quindi divisi in modo uniforme, con metà in fase di elaborazione per l’isolamento del DNA genomico in preparazione per il sequenziamento e la generazione della libreria, e l’altra metà riservata all’estrazione di mRNA per i nostri studi proteomici.
Abbiamo quindi eseguito strisci e identificato i vari tipi di cellule che abbiamo osservato. L’identificazione delle cellule immunitarie nel sangue di drago di Komodo è difficile a causa della letteratura pubblicata limitata per riferimento. I vari tipi di cellule che sono stati osservati negli strisci di sangue colorati da Wright sono mostrati in Fig. 2. Abbiamo identificato queste cellule in base alla somiglianza con le cellule immunitarie che avevamo precedentemente identificato nel sangue di alligatore americano . Di interesse erano i globuli rossi nucleati grandi e allungati di questo rettile. Inoltre, siamo stati in grado di identificare eterofili (simili ai granulociti), una probabile fonte di peptidi catelicidinici, nonché cellule monocitarie e linfocitarie.
Drago di Komodo globuli rossi e cellule immunitarie. Le cellule del sangue di Komodo dragon sono state visualizzate da Wright stain e imaged a 40x. I tipi di cellule sono identificati come: A. globuli rossi nucleati, B. monociti, C. linfociti e D. eterofili
Un secondo campione di sangue di drago di Komodo è stato successivamente raccolto ed elaborato per l’estrazione del DNA genomico dalla genomica a coda di rondine per il sequenziamento aggiuntivo. I ricercatori della Genomica a coda di rondine non hanno separato i globuli bianchi e hanno invece estratto il DNA dalle cellule pellettate direttamente dal sangue intero.
Assemblaggio e annotazione del genoma del drago di Komodo
Le precedenti analisi degli eritrociti del drago di Komodo utilizzando la citometria a flusso stimavano che il genoma fosse di circa 1,93 Gb . Utilizzando profondo Illumina sequenziamento e coda di rondine approcci, abbiamo ottenuto un progetto di assemblaggio del genoma che era 1,60 Gb di grandi dimensioni, simile alla dimensione del genoma di A. carolinensis lizard genoma che è 1,78 Gb . Il progetto di montaggio contiene 67.605 scaffold con N50 di 23,2 Mb (Tabella 1). Sono stati previsti un totale di 17.213 geni e 16.757 (97,35%) di essi sono stati annotati. Le stime di completezza con CEGMA sono state del 56% (“completo”) e del 94% (“parziale”). La percentuale stimata di ripetizioni nel genoma è 35.05% con la maggior parte delle linee (38.4%) e SINEs (5.56%) (File aggiuntivo 1: Fig. S1 & File aggiuntivo 2: Tabella S1). I dati genomici saranno disponibili presso NCBI con letture di sequenziamento raw depositate nell’archivio Sequence Read (#SRP161190) e l’assemblaggio del genoma presso DDBJ/EN/GenBank sotto l’adesione # VEXN00000000. La versione di assemblaggio descritta in questo documento è VEXN01000000.
Identificazione di potenziali immunità innata e geni peptidici antimicrobici
L’immunità innata nei rettili è un aspetto critico del loro successo evolutivo, ma rimane poco conosciuta in questi animali. L’immunità innata è definita come quegli aspetti dell’immunità che non sono anticorpi e non cellule T. Le risposte immunitarie innate agli agenti patogeni invasori possono includere l’espressione di citochine; l’attivazione e il reclutamento di macrofagi, leucociti e altri globuli bianchi; e l’espressione di peptidi antimicrobici come le defensine e le catelicidine .
Abbiamo adottato un approccio basato sulla genomica per identificare i geni di immunità innata nel genoma del drago di Komodo in questo lavoro. Abbiamo sequenziato il genoma di Komodo e lo abbiamo esaminato per geni e cluster di importanti geni peptidici antimicrobici dell’immunità innata (β-defensine, ovodefensine e catelicidine), che sono probabilmente coinvolti nelle espressioni di immunità innata in questa lucertola gigante.
la β-defensina ed i geni relativi nel genoma di Komodo
Le defensine sono un esempio dei peptidi antimicrobici disolfuro-stabilizzati, con le β-defensine che sono una famiglia unicamente vertebrata dei peptidi antimicrobici disolfuro-stabilizzati e cationici coinvolti nella resistenza alla colonizzazione microbica alle superfici epiteliali . I peptidi di β-defensin sono definiti da un motivo caratteristico della sei-cisteina con il gioco conservato del residuo della cisteina (C–X6–C–X (3-5)–C–X (8-10)–C–X6–CC) ed il modello associato di legame del disolfuro (Cys1-Cys5, Cys2-Cys4 e Cys3-Cys6); tuttavia, le variazioni nel numero e nella spaziatura fra i residui Come con altri peptidi antimicrobici cationici, le β-defensine presentano tipicamente una carica netta positiva (cationica, basica).
Una delle prime ampie segnalazioni di un ruolo in vivo per l’espressione del peptide β-defensina nei rettili è l’espressione inducibile di β-defensine nelle lucertole anole ferite (Anolis carolinensis) . Neutrofili rettile sembrano avere granuli che contengono sia peptidi cathelicidin-like così come peptidi β-defensin. peptidi β-defensin-like si trovano anche nelle uova di rettile . È noto che alcune specie di lucertola possono perdere la coda come metodo di fuga dei predatori e che queste code si rigenerano dal sito della ferita senza infiammazione o infezione. i peptidi β-defensin sono espressi sia all’interno dei granulociti azurofili nel letto della ferita che nell’epitelio associato e sono osservati nei fagosomi contenenti batteri degradati. C’è una distinta mancanza di infiammazione nella ferita, che è associata alla rigenerazione, e due β-defensine in particolare sono espresse ad alti livelli nei tessuti di guarigione Nel complesso, sembra che ci sia un ruolo significativo per le β-defensine nella guarigione della ferita e rigenerazione nella lucertola anole .
i geni β-defensin sono stati generalmente osservati per risiedere in gruppi all’interno dei genomi dei vertebrati . Negli esseri umani, ben 33 geni β-defensin sono stati identificati in cinque cluster . Recentemente, analisi dei genomi di diverse specie aviarie tra cui anatra, fringuello zebra e pollo ha rivelato che il genoma di ogni specie conteneva un cluster β-defensin . Un cluster genico simile alla β-defensina è stato recentemente identificato nella lucertola anole (Prickett, M. D., lavori in corso non pubblicati), che è strettamente correlata al drago di Komodo . È interessante notare che il gene della catepsina B (CTSB) è stato identificato come un marcatore forte per i cluster di β-defensina negli esseri umani, nei topi e nei polli . Pertanto, abbiamo esaminato il genoma di Komodo per il gene catepsina B (CTSB) come potenziale marcatore per aiutare nell’identificazione del cluster β-defensin(s) in esso.
Attraverso queste analisi, abbiamo identificato un totale di 66 potenziali geni β-defensina nel genoma del drago di Komodo, di cui 18 si pensa che siano geni β-defensina specifici del drago di Komodo (Tabella 2). I geni β-defensin identificati dal genoma del drago di Komodo mostrano variazioni nella spaziatura della cisteina, nella dimensione del gene, nel numero di residui di cisteina che comprendono il dominio β-defensin, nonché nel numero di domini β-defensin. Rispetto al residuo di cisteina conservato spaziatura, soprattutto alla fine (C–X6–C–X (3-5)–C–X (8-10)–C–X6–CC), abbiamo trovato una notevole variabilità nella nostra analisi del beta-defensina geni del drago di Komodo genoma, in cinque drago di Komodo beta-defensina geni sono sette si trova tra gli ultimi cisteine, 16 sono sei residui tra l’ultimo cisteine, 42 sono cinque residui tra l’ultimo cisteine, e tre drago di Komodo beta-defensina geni presentano più complessi di cisteina residuo spaziatura modelli (Tabella 2).
Come per gli uccelli e altri rettili, la maggior parte dei geni della defensina del drago di Komodo sembra risiedere in due gruppi separati all’interno dello stesso blocco sintenico (Fig. 3). Un cluster è un cluster β-ovodefensina affiancato su un’estremità dal gene per XK, Kell blood group complex subunity-related family, membro 6 (XKR6) e dall’altra estremità dal gene per la proteina correlata alla Miotubularina 9 (MTMR9). La regione intercluster di circa 400.000 bp include i geni per la famiglia con somiglianza di sequenza 167, membro A (FAM167A); Proto-oncogene BLK, tirosina chinasi della famiglia Src (BLK); Farnesil-difosfato farnesil transferasi 1 (FDFT1); e CTSB (catepsina B), che è un gene di accompagnamento per il cluster β-defensina (Fig. 3). Negli uccelli, nelle tartarughe e nei coccodrilli, l’altra estremità del cluster β-defensin è seguita dal gene per la traslocazione associata alla proteina di membrana 2 (TRAM2). Come nel caso di tutti gli altri genomi squamati (lucertole e serpenti) esaminati, il gene di accompagnamento per la fine del cluster β-defensina non può essere determinato in modo definitivo al momento in quanto non ci sono genomi squamati con cluster intatti disponibili.
cluster della famiglia genica β-defensina. Posizioni dell’impalcatura dei geni identificati di defensina e ovodefensina del drago di Komodo, evidenziando i cluster di defensina e ovodefensina nel genoma del drago di Komodo
La fine del cluster potrebbe essere affiancata da XPO1 o TRAM2 o nessuno dei due. Due dei tre geni trovati sullo scaffold 45 con TRAM2 (VkBD80a, VkBD80b) sono quasi identici e potenzialmente il risultato di un artefatto di assemblaggio. I geni sono ortologhi per il gene finale nei cluster di β-defensina aviaria, tartaruga e coccodrillo. L’ortolog di anolo per questo gene è isolato e non è associato a TRAM2, XPO1, né ad altre β-defensine, e non ci sono β-defensine trovate in prossimità di anolo TRAM2. Due dei sette geni associati con XPO1 hanno ortologs con uno dei cinque geni anolo associati con XPO1, ma non può essere determinato in entrambe le specie se questi sono parte del resto del cluster β-defensin o parte di un cluster aggiuntivo. Gli ortologhi del serpente sono associati a TRAM2 ma non fanno parte del cluster.
Diversità strutturale
La diversità può essere vista nelle variazioni nella struttura del dominio β-defensin. Tipicamente, una β-defensina consiste di 2-3 esoni: un peptide di segnale, un esone con il dominio propiece e β-defensin con sei cisteine e, in alcuni casi, un breve terzo esone. Variazioni nel numero di domini β-defensina, dimensione dell’esone, numero di esoni, spaziatura atipica delle cisteine e/o il numero di cisteine nel dominio β-defensina possono essere trovate in tutte le specie di rettili esaminate (non pubblicate). Esistono tre β-defensine con due domini di defensina (VkBD7, VkBD34 e VkBD43) e una con tre domini di defensina (VkBD39). I geni β-defensin del drago di Komodo VkBD12, VkBD13 e VkBD14 e i loro ortologhi negli anoli hanno esoni atipicamente grandi. Il gruppo di β-defensine tra VkBD16 e VkBD21 ha anche esoni atipicamente grandi. La spaziatura atipica tra i residui di cisteina si trova in tre β-defensine, VkBD20 (1-3-9-7), VkBD57 (3-4-8-5) e VkBD79 (3-10-16-6). Ci sono quattro β-defensine con residui addizionali di cisteina nel dominio β-defensina: VkBD6 con 10 residui di cisteina e un gruppo di tre β-defensine, VkBD16, VkBD17 e VkBD18, con otto residui di cisteina.
I due domini β-defensin di VkBD7 sono omologhi a quello β-defensin di VkBD8 con ortologhi in altre specie di Squamata. Nella lucertola anole A. carolinensis ci sono due ortologhi, LzBD6 con un dominio β-defensina e il non-cluster LzBD82 con due domini β-defensina. Gli ortologi nei serpenti (SnBD5 e SnBD6) hanno un dominio β-defensin. VkBD34 è un ortolog di LzBD39 in anole e SnBD15 in serpenti. VkBD39 e VkBD43 sono costituiti rispettivamente da tre e due domini β-defensin omologhi, che sono omologhi ai terzi esoni di LzBD52, LzBD53 e LzBD55, che hanno tutti due domini β-defensin non omologhi. VkBD40 con un dominio β-defensin è omologa ai secondi esoni di LzBD52, LzBD53, LzBD54 (con un dominio defensin) e LzBD55.
Un aumento del numero di cisteine nel dominio β-defensina provoca la possibilità di formare ulteriori ponti disolfuro. Esempi di questa variazione possono essere trovati nella psittacina β-defensin, Psittaciforme AvBD12 . Il dominio β-defensin di VkBD6 sembra essere costituito da 10 cisteine, quattro delle quali fanno parte di un’estensione dopo un tipico dominio β-defensin con una cisteina accoppiata aggiuntiva (C-X6-C-X4-C-X9-C-X6-CC-X7-C-X7-CC-X5-C). Il gruppo di Komodo β-defensins VkBD16, VkBD17 e VkBD18, oltre ad avere una spaziatura atipica della cisteina, inoltre ha otto cisteine all’interno di un numero tipico dei residui. Il β-defensin che segue questo gruppo, VkBD19, è un paralog di questi tre geni; tuttavia, il dominio del β-defensin contiene i sei residui più tipici della cisteina.
Le strutture geniche di questi geni della β-defensina di Komodo sono soggette a conferma con prove a sostegno. Ci sono un certo numero di elementi di struttura atipici nelle lucertole anole, tra cui esoni aggiuntivi del dominio non β-defensin o esoni più grandi.
Le analisi delle sequenze peptidiche codificate dai geni β-defensin del drago di Komodo recentemente identificati hanno rivelato che la maggior parte (53 su 66) di loro è prevista per avere una carica positiva netta alle circostanze fisiologiche, come è tipico per questa classe di peptide antimicrobico (Tabella 3). Tuttavia, è notevole che quattro peptidi (VkBD10, VkBD28, VkBD30 e VkBD34) sono previsti debolmente cationici o neutri (+ 0,5–0) a pH 7, mentre nove peptidi (VkBD3, VkBD4, VkBD11, VkBD19, VkBD23, VkBD26, VkBD35, VkBD36 e VkBD37) sono previsti da debolmente a fortemente anionici. Questi risultati suggeriscono che mentre questi peptidi presentano caratteristiche strutturali β-defensin canoniche e risiedono in cluster di geni β-defensin, uno o più di questi geni potrebbero non codificare per peptidi β-defensin-like o β-defensins canonici, perché le β-defensine sono tipicamente cationiche e la loro carica positiva contribuisce alla loro attività antimicrobica.
Identificazione dei geni dell’ovodefensina del drago di Komodo
I geni dell’ovodefensina sono stati trovati in più specie di uccelli e rettili, con espressione trovata nell’albume d’uovo e in altri tessuti. È stato dimostrato che le ovodefensine, incluso il peptide di pollo gallin (Gallus gallus OvoDA1), hanno attività antimicrobica contro l’E. coli Gram-negativo e lo S. aureus Gram-positivo. Le β-ovodefensine presuntive si trovano in un cluster nello stesso blocco sintenico del cluster β-defensin negli uccelli e nei rettili. Ci sono stati 19 β-ovodefensine trovati in A. carolinensis (uno con un dominio di otto cisteina β-defensina) e cinque in serpenti (quattro con un dominio di otto cisteina β-defensina) (Prickett, MD, lavori inediti in corso). Il cluster drago di Komodo è costituito da sei β-ovodefensine (Tabelle 4 e 5). Due di questi possono essere specifici del drago di Komodo; VkOVOD1, che è uno pseudoè un ortologo di SnOVOD1 oltre alla prima β-ovodefensina nelle tartarughe e nei coccodrilli. I domini di defensina VkOVOD3, VkOVOD4 e VkOVOD6 sono costituiti da otto cisteine, ortologhi di SnOVOD2, SnOVOD3 e SnOVOD5, rispettivamente. VkOVOD4 e VkOVOD6 sono ortologhi di LzOVOD14.
Identificazione del drago di Komodo cathelicidin geni
Cathelcidin peptide geni sono stati identificati rettili mediante approcci di genomica . Diversi geni peptidici cathelicidin sono stati identificati in uccelli, serpenti e la lucertola anole . Il rilascio dei peptidi antimicrobici funzionali della catelicidina è stato osservato dagli eterofili del pollo, suggerenti che gli eterofili del rettile possono anche essere una fonte di questi peptidi . Alibardi et al. hanno identificato i peptidi di cathelicidin che sono espressi nei tessuti della lucertola dell’anolo, compreso associato con gli eterofili . Si pensa che i peptidi antimicrobici di Cathelicidin svolgano ruoli chiave nell’immunità innata in altri animali e quindi probabilmente svolgono questo ruolo anche nel drago di Komodo.
Nelle lucertole anole, il cluster genico cathelicidin, costituito da 4 geni, è organizzato come segue:< FASTK >cluster cathelicidin<KLHL18 >. Abbiamo cercato un ammasso di catelicidina simile nel genoma del drago di Komodo. La ricerca del genoma del drago di Komodo per i geni simili a cathelicidin ha rivelato un gruppo di tre geni che hanno un “dominio simile a cathelin”, che è il primo requisito di un gene cathelicidin, situato ad un’estremità di saffold 84. Tuttavia, questa regione dello scaffold 84 presenta problemi di assemblaggio con lacune, esoni isolati e duplicazioni. I geni identificati della catelicidina del drago di Komodo sono stati nominati dopo i loro ortologi dell’anolo. Due delle cathelicidine del drago di Komodo (Cathelicidin2 e Cathelicidin4.1) sono in sezioni senza problemi di assemblaggio. Al contrario, Cathlicidin4.2 è stato costruito utilizzando un insieme diversificato di esoni 1-3 e un esone 4 fuori luogo per creare un gene completo, che è paralogico a Cathelicidin4.1. Poiché il cluster si trova ad un’estremità dello scaffold, potrebbero esserci ulteriori catelicidine non identificate che non vengono catturate in questo assembly.
Una caratteristica comune delle sequenze del gene antimicrobico del peptide di cathelicidin è che il cathelin-dominio N-terminale codifica per almeno 4 cisteine. Nel nostro studio sulle catelicidine di alligatore e serpente abbiamo anche notato che in genere seguendo l’ultima cisteina, un pattern a tre residui costituito da VRR o sequenza simile precede immediatamente il peptide antimicrobico cationico C-terminale previsto . I requisiti supplementari di una sequenza antimicrobica del gene del peptide di cathelicidin sono che codifica per un peptide caricato netto-positivo nella regione del C-terminale, è codificato tipicamente dal quarto esone ed è tipicamente circa 35 aa di lunghezza (gamma 25-37) . Poiché la proteasi naturale responsabile della scissione e del rilascio dei peptidi antimicrobici funzionali non è nota, la previsione del sito esatto di scissione è difficile. Come si può vedere nella Tabella 6, sono elencate le sequenze amminoacidiche previste per ciascuno dei candidati identificati del gene della catelicidina del drago di Komodo. Eseguendo la nostra analisi su ogni sequenza, abbiamo fatto previsioni e conclusioni sul fatto che ogni potenziale gene della catelicidina possa codificare per un peptide antimicrobico.
Si può vedere che la sequenza proteica N-terminale prevista di Cathelicidin2_VARKO (VK-CATH2) contiene quattro cisteine (sottolineate, Tabella 6). Tuttavia, non c’è un ovvio “VRR” o una sequenza simile negli amminoacidi ~ 10 che seguono l’ultimo residuo di cisteina come abbiamo visto nelle sequenze di alligatore e cathelicidin correlate . Inoltre, l’analisi dei 35 aminoacidi C-terminali rivela una sequenza peptidica prevista priva di una carica positiva netta. Per questi motivi, prevediamo che la sequenza genica Cathelicidin2_VARKO non codifica per un peptide antimicrobico cathelicidin attivo al suo C-terminale (Tabella 7).
Per il identificate Cathelicidin4.1_VARKO gene, il predetto cathelin-dominio include il requisito quattro residui di cisteina (Tabella 6), e la sequenza di “VTR” è presente all’interno di 10 aminoacidi dell’ultimo cisteina, simile al “VRR” sequenza in alligatore cathelicidin gene . Si prevede che il peptide C-terminale 33-aa che segue la sequenza “VTR” abbia una carica netta + 12 a pH fisiologico e che una gran parte della sequenza sia elicoidale, che è coerente con le catelicidine. La maggior parte delle catelicidine conosciute contiene segmenti con una struttura elicoidale significativa . Infine, l’analisi della sequenza utilizzando il database di peptidi antimicrobici indica che il peptide è potenzialmente un peptide antimicrobico cationico . Quindi, prevediamo che questo gene probabilmente codifica per un peptide antimicrobico attivo di cathelicidin, chiamato VK-CATH4. 1 (Tabella 7).
Inoltre, questo peptide dimostra una certa omologia ad altri peptidi antimicrobici noti nel database dei peptidi antimicrobici (Tabella 8). Mostra un grado particolarmente elevato di somiglianza di sequenza ai peptidi cathelicidin identificati dagli squamati, con esempi inclusi nella Tabella 8. Così, il peptide previsto di VK-CATH4.1 ha molte delle caratteristiche del segno distintivo di un peptide di cathelicidin ed è un forte candidato per ulteriore studio. La tabella 8 mostra l’allineamento di VK_CATH4.1 con peptidi noti nel database dei peptidi antimicrobici .
Per il gene Cathelicidin4.2_VARKO identificato, il dominio cathelin previsto include i quattro residui di cisteina necessari (Tabella 6). Come è stato notato nel gene Cathelicidin4.1_VARKO, la sequenza “VTR” è presente all’interno di 10 aminoacidi del quarto residuo di cisteina e precede immediatamente il segmento C-terminale, che codifica per un peptide 30-aa che si prevede sia antimicrobico . Si prevede che la sequenza aminoacidica del peptide C-terminale abbia una carica netta + 10 a pH fisiologico e dimostra vari gradi di omologia ad altri peptidi antimicrobici noti nel database dei peptidi antimicrobici . Così, come VK-CATH4. 1, questo peptide del candidato inoltre esibisce molte delle caratteristiche del segno distintivo connesse con i peptidi di cathelicidin ed è un secondo forte candidato per ulteriore studio. La tabella 8 mostra l’omologia e l’allineamento di VK-CATH4.2 con peptidi noti dal database di peptidi antimicrobici. Infine, la sequenza genica che codifica il peptide funzionale VK-CATH4.2 si trova sull’esone 4, che è la posizione tipica del peptide attivo della catelicidina. Questo esone codifica la sequenza peptidica LDRVTRRRWRRFFQKAKRFVKRHGVSIAVGAYRIIG.
Il peptide previsto VK-CATH4.2 è altamente omologa con peptidi da altri geni cathelicidin predetto, con peptidi C-terminale predetto simili, da A. carolinensis, G. japonicus, e P. bivittatus (Tabella 8). Residui 2-27 di VK-CATH4.2 sono identici al 65% e simili all ‘ 80% all’anolo Cathelicidin-2 come il peptide C-terminale previsto (XP_008116755.1, aa 130-155). I residui 2-30 di VK-CATH4.2 sono identici al 66% e simili all ‘ 82% al peptide C-terminale predetto correlato al geco Cathelicidina (XP_015277841.1, aa 129-151). Infine, aa 2-24 di VK-CATH4.2 sono il 57% identici e il 73% simili al peptide C-terminale predetto simile a OH-CATH correlato alla cathelicidina (XP_007445036.1, aa 129-151).