Celletyper I Komodo drage blod
en prøve av blod ble oppnådd fra En Komodo drage som heter Tujah På Saint Augustine Alligator Farm Zoological Park i samsvar med nødvendige sikkerhets-og regulatoriske prosedyrer, og med passende godkjenninger. På innsamlingstidspunktet var vi interessert i å samle både genomisk DNA for sekvensering, samt mRNA for å generere et cDNA-bibliotek for å lette våre proteomiske studier. Hos fugler er heterofile (hvite blodlegemer) kjent for å uttrykke flere antimikrobielle peptider . Antimikrobielle peptider identifisert fra kylling heterofile utviser betydelige antimikrobielle og vert-rettet immunmodulerende aktiviteter . Følgelig, etter å ha oppnådd en første prøve av fersk Komodo-drageblod, tillot vi de hvite blodcellene å slå seg ut av blodet og samlet dem fordi de sannsynligvis ville være involvert i antimikrobielt peptiduttrykk. De oppsamlede komodo dragon hvite blodlegemer ble deretter delt jevnt, med halvparten behandlet for isolering av genomisk DNA som forberedelse til sekvensering og biblioteksgenerering, og den andre halvparten reservert for mRNA-ekstraksjon for våre proteomiske studier.
vi utførte deretter smører og identifiserte de forskjellige celletyper som vi observerte. Immuncelleidentifikasjon I komodo drageblod er utfordrende på grunn av begrenset publisert litteratur for referanse. De forskjellige celletyper som ble observert I wright-farget blodutstryk er vist I Fig. 2. Vi identifiserte disse cellene basert på likhet med immuncellene vi tidligere hadde identifisert i Det Amerikanske alligatorblodet . Av interesse var de store og langstrakte nukleerte røde blodcellene i denne reptilen. I tillegg var vi i stand til å identifisere heterofiler (lik granulocytter), en sannsynlig kilde til katelicidinpeptider, samt monocytt-og lymfocyttceller.
Komodo drage røde blodceller og immunceller. Blodceller fra komodo dragon ble visualisert Av wright stain og avbildet ved 40x. Celletyper er identifisert som: a. nukleert rød blodcelle, b. monocyt, c. lymfocyt og d. heterophil
En annen prøve Av komodo dragon blood ble senere samlet og behandlet for genomisk DNA-ekstraksjon ved Svalehale Genomikk for ytterligere sekvensering. Forskerne ved Dovetail Genomics separerte ikke hvite blodlegemer, og i stedet hentet DNA fra celler pelletert direkte fra fullblod.
Montering og annotering Av Komodo dragon genome
Tidligere analyser Av komodo dragon erytrocytter ved hjelp av flowcytometri anslått genomet til å være omtrent 1,93 Gb i størrelse . Ved hjelp av dyp Illumina sekvensering og Svalehale tilnærminger, fikk vi et utkast genom montering som var 1.60 Gb stor, lik genomet størrelsen På a. carolinensis lizard genom som er 1.78 Gb . Utkastet inneholder 67 605 stillas Med N50 på 23,2 Mb (Tabell 1). Totalt ble 17.213 gener spådd, og 16.757 (97.35%) av dem ble annotert. Fullstendighetsestimater med CEGMA var 56% (‘komplett’ ) og 94% (‘delvis’). Den estimerte prosentandelen av gjentakelser i genomet er 35,05% med flertallet Som Linjer (38,4%) og SINEs (5,56%) (Tilleggsfil 1: Fig. S1 & tilleggsfil 2: Tabell S1). Genomiske data vil være tilgjengelig PÅ NCBI med rå sekvensering leser deponert I Sekvensen Lese Arkivet (#SRP161190), og genomet montering PÅ DDBJ / Ena / GenBank under tiltredelse #VEXN00000000. Monteringsversjonen beskrevet i dette papiret ER VEXN01000000.
Identifisering av potensiell medfødt immunitet og antimikrobielle peptidgener
Medfødt immunitet hos reptiler er et kritisk aspekt av deres evolusjonære suksess, men det er fortsatt dårlig forstått hos disse dyrene. Medfødt immunitet er definert som de aspektene av immunitet som ikke er antistoffer og Ikke T-celler. Medfødte immunresponser mot invaderende patogener kan inkludere ekspresjon av cytokiner; aktivering og rekruttering av makrofager, leukocytter og andre hvite blodlegemer; og ekspresjon av antimikrobielle peptider som defensiner og katelicidiner .
Vi har tatt en genomikkbasert tilnærming til å identifisere medfødte immunitetsgener i Komodo dragon-genomet i dette arbeidet. Vi har sekvensert komodo-genomet og undersøkt det for gener og klynger av viktige medfødte immun antimikrobielle peptidgener (β-defensiner, ovodefensiner og katelicidiner), som sannsynligvis er involvert i uttrykk for medfødt immunitet i denne gigantiske firbenet.
β-Defensin og beslektede gener i komodo-genomet
Defensiner er ett eksempel på disulfidstabiliserte antimikrobielle peptider, med β-defensiner som en unik vertebratfamilie av disulfidstabiliserte, kationiske antimikrobielle peptider involvert i resistens mot mikrobiell kolonisering på epitelflater . Β-defensin-peptidene er definert av et karakteristisk seks-cysteinmotiv med konservert cysteinrestavstand (C–X6–C–X (3-5– – C – X (8-10– – C-X6-CC) og tilhørende disulfidbindingsmønster (Cys1-Cys5, Cys2-Cys4 og Cys3-Cys6); det er imidlertid observert variasjoner i antall og avstand mellom cysteinrester. Som for andre kationiske antimikrobielle peptider, utviser β-defensiner vanligvis en netto positiv (kationisk, grunnleggende) ladning.
En av de første omfattende rapportene om en in vivo-rolle for β – defensinpeptiduttrykk hos reptiler er det inducerbare uttrykket for β-defensiner hos sårede anoløgler (Anolis carolinensis) . Reptilnutrofiler ser ut til å ha granulat som inneholder både katelicidinlignende peptider og β-defensinpeptider. β-defensinlignende peptider finnes også i reptilegg . Det er velkjent at noen arter av firfirsle kan miste sine haler som en metode for rovdyrflukt, og at disse haler deretter regenererer fra sårstedet uten betennelse eller infeksjon. β-defensinpeptider uttrykkes både i azurofile granulocytter i sårsengen og i det tilhørende epitelet og observeres i fagosomer som inneholder degraderte bakterier. Det er en tydelig mangel på betennelse i såret, som er forbundet med regenerering, og spesielt to β-defensiner uttrykkes ved høye nivåer I helbredende vev Totalt sett ser det ut til å være en betydelig rolle for β-defensinene i sårheling og regenerering i anoløglen .
β-defensin-gener har generelt blitt observert å ligge i klynger innenfor genomene til vertebrater . Hos mennesker ble så mange som 33 β-defensin-gener identifisert i fem klynger . Nylig viste analyser av genomene til flere fuglearter, inkludert and, sebrafink og kylling, at genomet til hver art inneholdt en β-defensin-klynge . En β-defensin-lignende genhop har nylig blitt identifisert i anole lizard (Prickett, Md, upublisert arbeid pågår), som er nært knyttet Til Komodo-dragen . Interessant nok har cathepsin b-genet (CTSB) blitt identifisert som en sterk markør for β-defensin-klynger hos mennesker, mus og kyllinger . Dermed undersøkte Vi komodo-genomet for cathepsin B-genet (CTSB) som en potensiell markør for å hjelpe til med å identifisere den β-defensin-klyngen(e) deri.
gjennom disse analysene identifiserte vi totalt 66 potensielle β-defensingener i komodo-dragegenomet, hvorav 18 antas Å være Komodo-drage-spesifikke β-defensingener (Tabell 2). Β-defensin-genene identifisert fra komodo-dragegenomet viser variasjoner i cysteinavstand, genstørrelse, antall cysteinrester som utgjør β-defensin-domenet, samt antall β-defensin-domener. Med hensyn til den konserverte cysteinresteavstanden, spesielt på slutten (C–X6–C–X (3-5)–C–X (8-10)–C–X6–CC), fant vi betydelig variasjon i vår analyse av β-defensin-genene I Komodo-dragegenomet, ved at fem Komodo-drage β-defensin-gener har syv ligger mellom de siste cysteinene, 16 har seks rester mellom de siste cysteinene, 42 har fem rester mellom de siste cysteinene, og tre Komodo-drage β-defensin-gener utviser mer komplekse cystein-restavstandsmønstre (tabell 2).
som med fugler og andre reptiler, de fleste av komodo drage defensin gener synes å ligge i to separate klynger innenfor samme syntenic blokk (Fig. 3). En klynge er en β-ovodefensin-klynge flankert i den ene enden av genet FOR XK, kell blood group complex subunit-relatert familie, medlem 6 (XKR6) og i den andre enden av genet For Myotubularinrelatert protein 9 (MTMR9). Intercluster-regionen på ca 400 000 bp inkluderer gener For Familie med sekvenslikhet 167, medlem A (FAM167A); BLK proto-onkogen, Src-familie tyrosinkinase (BLK); Farnesyldifosfat farnesyltransferase 1 (FDFT1); OG CTSB (cathepsin B), som er et flankegen for den β-defensin-klyngen (Fig. 3). Hos fugler, skilpadder og krokodiller blir den andre enden av β-defensin-klyngen etterfulgt av genet FOR Translokasjon assosiert membranprotein 2 (TRAM2). Som det er tilfellet med alle de andre squamate-genomene (øgler og slanger) som er undersøkt, kan flankegenet for slutten av β-defensin-klyngen ikke definitivt bestemmes for tiden, da det ikke finnes noen squamate-genomer med intakte klynger tilgjengelig.
β-defensin-genfamilieklynger. Stillasplasseringer av de identifiserte Komodo dragon defensin og ovodefensin gener, fremhever defensin og ovodefensin klynger i Komodo dragon genome
enden av klyngen kan enten flankeres AV XPO1 eller TRAM2 eller ingen av delene. To av de tre genene som finnes på stillas 45 MED TRAM2 (VkBD80a, VkBD80b) er nesten identiske og potensielt resultatet av en samlingsartefakt. Genene er orthologer for det endelige genet i aviær -, skilpadde-og crocodilian β-defensin-klyngene. Anolorthologen for dette genet er isolert og er ikke forbundet MED TRAM2, XPO1 eller noen andre β-defensiner, og det finnes ingen β-defensiner i nærheten av anole TRAM2. To av de syv genene som er forbundet MED XPO1 har orthologer med ett av de fem anolgenene som er forbundet MED XPO1, men det kan ikke fastslås i noen av artene om disse er en del av resten AV β-defensin-klyngen eller en del av en ekstra klynge. Slangeorthologene er forbundet MED TRAM2, men er ikke en del av klyngen.
Strukturelt mangfold
Mangfold kan ses i variasjoner i strukturen til det β-defensin-domenet. Typisk består en β-defensin av 2-3 eksoner: et signalpeptid, en ekson med propiece og β-defensin-domene med seks cystein, og i noen tilfeller en kort tredje ekson. Variasjoner i antall hryvnias-defensin-domener, eksonstørrelse, eksonnummer, atypisk avstand mellom cysteinene og/eller antall cystein i β-defensin-domenet finnes hos alle undersøkte krypdyrarter (upubliserte). Det er tre β-defensiner med to defensin-domener (VkBD7, VkBD34 og VkBD43) og en med tre defensin-domener (VkBD39). Komodo-dragen β-defensin-genene VkBD12, VkBD13 og VkBD14 og deres orthologer i anoler har atypisk store eksoner. Gruppen av β mellom VkBD16 Og VkBD21 har også atypisk store eksoner. Atypisk avstand mellom cysteinrester finnes i tre β-defensiner, VkBD20 (1-3-9-7), VkBD57 (3-4-8-5) og VkBD79 (3-10-16-6). Det er fire β-defensiner med ekstra cysteinrester i β: VkBD6 med 10 cysteinrester, og en gruppe på tre β-defensiner, VkBD16, VkBD17 og VkBD18, med åtte cysteinrester.
de to β-defensin-domenene Til VkBD7 er homologe til det ene β-defensin-domenet Til VkBD8 med orthologer i andre Arter Av Squamata. I anole lizard A. carolinensis er det to orthologer, LzBD6 med ett β-defensin-domene og Ikke-klyngen LzBD82 med to β-defensin-domener. Orthologene i slanger (SnBD5 og SnBD6) har ett β-defensin-domene. VkBD34 er en ortolog av LzBD39 i anoler og SnBD15 i slanger. VkBD39 og VkBD43 består av henholdsvis tre og to homologe hryvnias-defensin-domener, som er homologe med de tredje eksonene LzBD52, LzBD53 og LzBD55, som alle har to ikke-homologe hryvnias-defensin-domener. VkBD40 med ett β-defensin-domene er homolog til de andre eksonene Av LzBD52, LzBD53, LzBD54 (med ett defensin-domene) og LzBD55.
en økning i antall cystein i β-defensin-domenet resulterer i muligens å danne ytterligere disulfidbroer. Eksempler på denne variasjonen finnes i psittacine β-defensin, Psittaciforme AvBD12 . Β-defensin-domenet Til VkBD6 ser ut til å bestå av 10 cystein, hvorav fire er en del av en forlengelse etter et typisk β-defensin-domene med et ekstra paret cystein (C-X6-C-X4-C-X9-C-X6-CC-X7-C-X7-CC-X5-C). Gruppen Av komodo β-defensiner VkBD16, VkBD17 Og VkBD18, i Tillegg til å ha en atypisk cysteinavstand, har også åtte cystein innenfor et typisk antall rester. Β-defensin som følger denne gruppen, VkBD19, er en paralog av disse tre genene; derimot inneholder β-defensin-domenet de mer typiske seks cysteinrester.
genstrukturene til Disse komodo β-defensin-genene er gjenstand for bekreftelse med støttende bevis. Det finnes en rekke atypiske strukturelementer i anole øgler inkludert ekstra ikke-β-defensin domene exons eller større exons.
Analyser av peptidsekvensene kodet av de nylig identifiserte komodo dragon β-defensin-genene viste at flertallet (53 av 66) av dem antas å ha en netto positiv ladning ved fysiologiske forhold, som er typisk for denne klassen av antimikrobielt peptid (Tabell 3). Det er imidlertid bemerkelsesverdig at fire peptider (VkBD10, VkBD28, VkBD30 og VkBD34) antas å være svakt kationiske eller nøytrale (+0,5–0) ved pH 7, mens ni peptider (VkBD3, VkBD4, VkBD11, VkBD19, VkBD23, VkBD26, VkBD35, VkBD36 og VkBD37) antas å være svakt til sterkt anioniske. Disse funnene tyder på at mens disse peptidene har strukturelle trekk ved β-defensin og befinner seg i β-defensin-genklynger, kan ett eller flere av disse genene ikke kode for β-defensin-lignende peptider eller kanoniske β-defensiner, fordi β-defensiner vanligvis er kationiske og deres positive ladning bidrar til deres antimikrobielle aktivitet.
Identifikasjon av komodo dragon ovodefensin gener
Ovodefensin gener har blitt funnet i flere fugle-og reptilarter, med uttrykk funnet i egghvite og andre vev. Ovodefensiner inkludert kyllingpeptidet gallin (Gallus gallus OvoDA1) har vist seg å ha antimikrobiell aktivitet mot Den Gram-negative E. coli og Den Gram-positive s. aureus. Presumptive ③ – ovodefensins finnes i en klynge i samme synteniske blokk som den β-defensin-klyngen hos fugler og reptiler. Det har vært 19 β-ovodefensins funnet I A. carolinensis (en med et åtte cystein β-defensin-domene) og fem i slanger (fire med et åtte cystein β-defensin-domene) (Prickett, M. D., upublisert arbeid pågår). Komodo-drageklyngen består av seks β-ovodefensiner (Tabell 4 og 5). To av disse kan være Komodo drage spesifikke; VkOVOD1, som er en pseudois en ortolog Av SnOVOD1 i tillegg til den første β-ovodefensin i skilpadder og krokodiller. Defensin-domenene VkOVOD3, VkOVOD4 og VkOVOD6 består av åtte cystein, orthologer Av Henholdsvis SnOVOD2, SnOVOD3 og SnOVOD5. VkOVOD4 og VkOVOD6 er orthologer Av LzOVOD14.
Identifikasjon av Komodo dragon cathelicidin gener
Cathelcidin peptid gener har nylig blitt identifisert i reptiler gjennom genomiske tilnærminger . Flere cathelicidin peptid gener har blitt identifisert i fugler, slanger og anole øgle . Frigjøring av funksjonelle katelicidin antimikrobielle peptider har blitt observert fra kylling heterofile, noe som tyder på at krypdyr heterofile kan også være en kilde til disse peptidene . Alibardi et al. har identifisert katelicidin peptider blir uttrykt i anol øgle vev, inkludert assosiert med heterofile . Cathelicidin antimikrobielle peptider antas å spille nøkkelroller i medfødt immunitet hos andre dyr og så sannsynlig spille denne rollen i Komodo dragon også.
i anol øgler er cathelicidin – genklyngenet, bestående av 4 gener, organisert som følger:< FASTK > cathelicidin-klyngen < KLHL18>. Vi søkte etter en lignende cathelicidin-klynge i Komodo dragon-genomet. Søker På komodo dragon genomet for cathelicidin-lignende gener avslørte en klynge av tre gener som har et «cathelin-lignende domene», som er det første kravet til et cathelicidin-gen, som ligger i den ene enden av saffold 84. Denne regionen av stillas 84 har imidlertid monteringsproblemer med hull, isolerte eksoner og duplikasjoner. Identifiserte komodo drage cathelicidin gener har blitt oppkalt etter deres anole orthologs. To av komodo dragon cathelicidins (Cathelicidin2 Og Cathelicidin4.1) er i seksjoner uten monteringsproblemer. Derimot Ble Cathlicidin4. 2 konstruert ved hjelp av et mangfoldig sett med eksoner 1-3 og en feilplassert ekson 4 for å skape et komplett gen, som er paralogøst For Cathelicidin4.1. Som klyngen er funnet i den ene enden av stillaset, det kan være flere uidentifiserte cathelicidins som ikke er fanget i denne forsamlingen.
et felles trekk ved cathelicidin antimikrobielle peptid gensekvenser er At det N-terminale cathelin-domenet koder for minst 4 cystein. I vår studie av alligator og slange cathelicidins vi også bemerket at typisk etter den siste cystein, en tre-rest mønster bestående AV VRR eller lignende sekvens umiddelbart forut for spådd C-terminal kationisk antimikrobielle peptid . Tilleggskrav til en katelicidin antimikrobiell peptid gensekvens er at den koder for et netto-positivt ladet peptid I C-terminalområdet, det er typisk kodet av den fjerde exon, og det er typisk omtrent 35 aa i lengde (område 25-37). Siden naturlig forekommende protease som er ansvarlig for spaltning og frigjøring av funksjonelle antimikrobielle peptider ikke er kjent, er prediksjon av det nøyaktige spaltningsstedet vanskelig. Som det fremgår av Tabell 6, er de forutsagte aminosyresekvensene for hver av De identifiserte Komodo dragon cathelicidin genkandidatene listet opp. Ved å utføre vår analyse på hver sekvens, gjorde vi spådommer og konklusjoner om hvorvidt hvert potensielt katelicidin-gen kan kode for et antimikrobielt peptid.
det kan ses at den forventede n-terminale proteinsekvensen Av Cathelicidin2_VARKO (VK-CATH2) inneholder fire cystein (understreket, Tabell 6). Det er imidlertid ikke en åpenbar » VRR » eller lignende sekvens i ~ 10-aminosyrene etter den siste cysteinresten som vi så i alligatoren og relaterte katelicidinsekvenser . I tillegg viser analyse av de 35 C-terminale aminosyrene en spådd peptidsekvens som mangler en netto positiv ladning. Av disse grunner forutsier Vi at Cathelicidin2_VARKO-gensekvensen ikke koder for et aktivt katelicidin-antimikrobielt peptid ved C-endepunktet (Tabell 7).
for Det identifiserte Cathelicidin4. 1_varko-genet inneholder det forutsagte cathelin-domenet de nødvendige fire cysteinrester (Tabell 6), og sekvensen » VTR «er tilstede innen 10 aminosyrer av det siste cystein, som ligner» VRR » – sekvensen i alligatorkatelicidin-genet . Det 33-aa C-terminale peptidet etter» VTR » – sekvensen er spådd å ha en netto + 12-ladning ved fysiologisk pH, og en stor del av sekvensen er spådd å være spiralformet, noe som er konsistent med katelicidiner. De fleste kjente katelicidiner inneholder segmenter med betydelig spiralformet struktur . Endelig indikerer analyse av sekvensen ved Hjelp Av Den Antimikrobielle Peptiddatabasen at peptidet er potensielt et kationisk antimikrobielt peptid . Derfor forutsier vi at dette genet sannsynligvis koder for et aktivt katelicidin antimikrobielt peptid, kalt VK-CATH4.1 (Tabell 7).
i tillegg viser dette peptidet noe homologi til andre kjente antimikrobielle peptider i Den Antimikrobielle Peptiddatabasen (Tabell 8). Det viser en særlig høy grad av sekvenslikhet til katelicidin peptider identifisert fra squamates, med eksempler inkludert i Tabell 8. Dermed har det forutsagte vk-CATH4.1-peptidet mange av kjennetegnene til et katelicidinpeptid og er en sterk kandidat for videre studier. Tabell 8 viser justeringen AV VK_CATH4 .1 med kjente peptider i Den Antimikrobielle Peptiddatabasen.
For Det identifiserte Cathelicidin4. 2_varko-genet inneholder det forutsagte cathelin-domenet de nødvendige fire cysteinrester (Tabell 6). Som det ble notert I Cathelicidin4. 1_varko-genet, er sekvensen » VTR » tilstede innen 10 aminosyrer i den fjerde cysteinresten, og går straks foran Det C-terminale segmentet, som koder for et 30-aa-peptid som forventes å være antimikrobielt . Aminosyresekvensen Til det C-terminale peptidet antas å ha en netto + 10-ladning ved fysiologisk pH, og den demonstrerer varierte grader av homologi til andre kjente antimikrobielle peptider i Den Antimikrobielle Peptiddatabasen . Således, som VK-CATH4.1, viser dette kandidatpeptidet også mange av kjennetegnene som er forbundet med katelicidinpeptider, og er en annen sterk kandidat for videre studier. Tabell 8 viser homologi OG justering AV VK-CATH4.2 med kjente peptider fra Den Antimikrobielle Peptiddatabasen. Endelig er gensekvensen som koder for det funksjonelle peptidet VK-CATH4.2 funnet på ekson 4, som er den typiske plasseringen av det aktive katelicidinpeptidet. Dette exon koder for peptidsekvensen LDRVTRRRWRRFFQKAKRFVKRHGVSIAVGAYRIIG.
det forutsagte peptidet VK-CATH4.2 er svært homologt med peptider fra andre forutsagte cathelicidin-gener, med lignende forventede c-terminale peptider, Fra A. carolinensis, g. japonicus og P. bivittatus (Tabell 8). Rester 2-27 AV VK-CATH4.2 er 65% identiske og 80% lik Anol Cathelicidin-2 som spådd C-terminal peptid (XP_008116755. 1, aa 130-155). Rester 2-30 AV VK-CATH4.2 er 66% identiske og 82% lik gecko Cathelicidin-relatert spådd C-terminal peptid (XP_015277841. 1, aa 129-151). Endelig er aa 2-24 AV VK-CATH4.2 57% identiske og 73% lik Det Cathelicidin-relaterte OH-CATH-Lignende forventede C-terminale peptidet (XP_007445036. 1, aa 129-151).