celletyper i Komodo-drageblod
der blev opnået en blodprøve fra en Komodo-drage ved navn Tujah i Saint Augustine Alligator Farm dyrepark i overensstemmelse med de krævede sikkerheds-og forskriftsprocedurer og med passende procedurer for at sikre, at Komodo-drageblod godkendelser. På indsamlingstidspunktet var vi interesserede i at indsamle både genomisk DNA til sekventering såvel som mRNA for at generere et cDNA-bibliotek for at lette vores proteomiske studier. Hos fugle er heterofilerne (hvide blodlegemer) kendt for at udtrykke flere antimikrobielle peptider . Antimikrobielle peptider identificeret fra kyllingheterofile udviser signifikante antimikrobielle og værtsstyrede immunmodulerende aktiviteter . Efter at have opnået en indledende prøve af frisk Komodo dragon-blod tillod vi derfor de hvide blodlegemer at slå sig ud af blodet og opsamlede dem, fordi de sandsynligvis ville være involveret i antimikrobielt peptidekspression. De indsamlede hvide blodlegemer fra Komodo dragon blev derefter delt jævnt, hvor halvdelen blev behandlet til isolering af genomisk DNA som forberedelse til sekventering og biblioteksgenerering, og den anden halvdel forbeholdt mRNA-ekstraktion til vores proteomiske undersøgelser.
vi udførte derefter udstrygninger og identificerede de forskellige celletyper, som vi observerede. Immuncelleidentifikation i Komodo dragon blood er udfordrende på grund af begrænset offentliggjort litteratur til reference. De forskellige celletyper, der blev observeret i røde farvede blodudstrygninger, er vist i Fig. 2. Vi identificerede disse celler baseret på lighed med de immunceller, vi tidligere havde identificeret i det amerikanske alligatorblod . Af interesse var de store og aflange nukleerede røde blodlegemer i dette krybdyr. Derudover var vi i stand til at identificere heterofiler (svarende til granulocytter), en sandsynlig kilde til cathelicidinpeptider, såvel som monocyt-og lymfocytceller.
Komodo dragon røde blodlegemer og immunceller. Blodceller fra komodo dragon blev visualiseret ved Vrig plet og afbildet ved 40 gange. celletyper identificeres som: A. nucleated røde blodlegemer, B. monocyt, C. lymfocyt og D. heterophil
en anden prøve af Komodo-drageblod blev senere opsamlet og behandlet til genomisk DNA-ekstraktion ved svalehale-genomik til yderligere sekventering. Forskerne ved Dovetail Genomics adskilte ikke hvide blodlegemer og ekstraherede i stedet DNA fra celler pelleteret direkte fra helblod.
samling og annotation af Komodo dragon genome
tidligere analyser af komodo dragon erythrocytter ved hjælp af strømningscytometri estimerede genomet til at være cirka 1,93 Gb i størrelse . Ved hjælp af dyb Illumina-sekventering og svalehale-tilgange opnåede vi en udkast til genomsamling, der var 1,60 Gb stor, svarende til genomstørrelsen af A. carolinensis firbengenom, som er 1,78 Gb . Udkastet til samling indeholder 67.605 stilladser med N50 på 23,2 Mb (tabel 1). I alt 17.213 gener blev forudsagt, og 16.757 (97,35%) af dem blev kommenteret. Fuldstændighedsestimater med CEGMA var 56% (‘komplet’) og 94% (‘delvis’). Den estimerede procentdel af gentagelser i genomet er 35,05%, hvor størstedelen er linjer (38,4%) og SINEs (5,56%) (yderligere fil 1: Fig. S1 & yderligere fil 2: Tabel S1). Genomiske data vil være tilgængelige på NCBI med rå sekventering læser deponeret i Sekvenslæsearkivet (#SRP161190) og genomsamlingen på DDBJ/Ena/GenBank under tiltrædelsen #irriterende 00000000. Monteringsversionen beskrevet i dette papir er VEKSN01000000.
identifikation af potentiel medfødt immunitet og antimikrobielle peptidgener
medfødt immunitet hos krybdyr er et kritisk aspekt af deres evolutionære succes, men det forbliver dårligt forstået hos disse dyr. Medfødt immunitet defineres som de aspekter af immunitet, der ikke er antistoffer og ikke T-celler. Medfødte immunresponser på invaderende patogener kan omfatte ekspression af cytokiner; aktivering og rekruttering af makrofager, leukocytter og andre hvide blodlegemer; og ekspression af antimikrobielle peptider såsom defensiner og cathelicidiner .
vi har taget en genomikbaseret tilgang til at identificere medfødte immunitetsgener i Komodo dragon-genomet i dette arbejde. Vi har sekventeret Komodo-genomet og undersøgt det for gener og klynger af vigtige medfødte immunitetsantibiotiske peptidgener (Krish-defensiner, ovodefensiner og cathelicidiner), som sandsynligvis er involveret i udtryk for medfødt immunitet i denne kæmpe firben.
Kris-Defensin og beslægtede gener i Komodo-genomet
Defensiner er et eksempel på disulfidstabiliserede antimikrobielle peptider, hvor Kris-defensiner er en unik hvirveldyr-familie af disulfidstabiliserede, kationiske antimikrobielle peptider involveret i resistensen mod mikrobiel kolonisering på epiteloverflader . Peptiderne er defineret af et karakteristisk seks-cysteinmotiv med konserveret cysteinrestafstand (C–6–C–3-5)–C–H (8-10)–C–6–CC) og tilhørende disulfidbindingsmønster (Cys1-Cys5, Cys2-Cys4 og Cys3-Cys6); der er dog observeret variationer i antallet af og afstanden mellem cysteinrester. Som med andre kationiske antimikrobielle peptider udviser kurp-defensiner typisk en nettopositiv (kationisk, basisk) ladning.
en af de første omfattende rapporter om en in vivo-rolle for peptidekspression i reptiler er den inducerbare ekspression af Kurt-defensiner i sårede anole-firben (Anolis carolinensis) . Reptilneutrofiler ser ud til at have granulater, der indeholder både cathelicidin-lignende peptider såvel som Kurt-defensin-peptider. i reptilæg findes der også peptider, der ligner L.-defensin . Det er velkendt, at nogle arter af firben kan miste deres haler som en metode til rovdyrflugt, og at disse haler derefter regenererer fra sårstedet uden betændelse eller infektion. peptiderne i peptiderne udtrykkes både i de acurofile granulocytter i sårlejet såvel som i det associerede epitel og observeres i fagosomer, der indeholder nedbrudte bakterier. Der er en tydelig mangel på betændelse i såret, som er forbundet med regenerering, og især to Karr-defensiner udtrykkes i høje niveauer i det helende væv generelt ser det ud til, at der er en væsentlig rolle for Karr-defensinerne i sårheling og regenerering i anole-firben .
det er generelt blevet observeret, at der findes gener i genomerne hos hvirveldyr . Hos mennesker blev der identificeret så mange som 33 Karp-defensin-gener i fem klynger . For nylig, analyser af genomerne fra flere fuglearter inklusive ænder, Sebra Fink og kylling afslørede, at genomet af hver art indeholdt en LARP-defensin-klynge . En Kris-defensin-lignende genklynge er for nylig blevet identificeret i anole-firbenet (Prickett, M. D., upubliceret igangværende arbejde), som er tæt knyttet til Komodo-dragen . Interessant nok er cathepsin B-genet (CTSB) blevet identificeret som en stærk markør for LARP-defensin-klynger hos mennesker, mus og kyllinger . Således undersøgte vi Komodo-genomet for cathepsin B-genet (CTSB) som en potentiel markør til at hjælpe med identifikationen af de(n) Krish-defensin-klynge (er) deri.
gennem disse analyser identificerede vi i alt 66 potentielle karrus-defensin-gener i Komodo-dragegenomet, hvoraf 18 menes at være Komodo-dragespecifikke karrus-defensin-gener (tabel 2). De identificeret fra Komodo-dragegenomet identificerede genomer af Krishna-defensin udviser variationer i cysteinafstand, genstørrelse, antallet af cysteinrester, der udgør det primære domæne af Krishna-defensin, såvel som antallet af Krishna-defensin-domæner. Med hensyn til den konserverede cysteinrest afstand, især i slutningen (C–6–C–3-5)–C–H (8-10)–C–6–CC), fandt vi betydelig variation i vores Analyse af Karr-defensin-generne i Komodo-dragegenomet, idet fem Komodo-drage-Karr-defensin-gener har syv bor mellem de sidste cysteiner, 16 har seks rester mellem de sidste cysteiner, 42 har fem rester mellem de sidste cysteiner og tre Karr-drage-Karr-defensin-gener har syv bor mellem de sidste cysteiner, 16 har seks rester mellem de sidste cysteiner, 42 har fem rester mellem de sidste cysteiner og tre defensin-gener udviser mere komplekse cystein-restafstandsmønstre (tabel 2).
som med fugle og andre krybdyr ser størstedelen af Komodo dragon defensin-gener ud til at opholde sig i to separate klynger inden for den samme synteniske blok (Fig. 3). Den ene klynge er en klynge, der er flankeret i den ene ende af genet for HK, kell-blodgruppekompleks underenheds-relateret familie, medlem 6 (HKR6) og i den anden ende af genet for Myotubularin-relateret protein 9 (MTMR9). 400.000 bp inkluderer generne til familie med sekvenslighed 167, medlem a (FAM167A); BLK proto-oncogen, Src-familie tyrosinkinase (BLK); Farnesyl-diphosphat farnesyltransferase 1 (FDFT1); og CTSB (cathepsin B), som er et flankerende gen for Larss-defensin-klyngen (Fig. 3). Hos fugle, skildpadder og krokodiller efterfølges den anden ende af Larus-defensin-klyngen af genet for Translokationsassocieret membranprotein 2 (TRAM2). Som det er tilfældet med alle de andre undersøgte genomer (firben og slanger) genomer, kan det flankerende gen for slutningen af Krish-defensin-klyngen ikke definitivt bestemmes på nuværende tidspunkt, da der ikke er nogen kvævede genomer med intakte klynger til rådighed.
genfamilieklynger af Gen-defensin. Stilladsplaceringer af de identificerede komodo dragon defensin-og ovodefensin-gener, der fremhæver defensin-og ovodefensin-klyngerne i Komodo dragon-genomet
enden af klyngen kunne enten flankeres af KSPO1 eller TRAM2 eller ingen af dem. To af de tre gener, der findes på stillads 45 med TRAM2 (VkBD80a, VkBD80b) er næsten identiske og potentielt resultatet af en samlingsartefakt. Generne er orthologs for det endelige gen i fugle -, skildpaddeog krokodilian LARP-defensin klynger. Anolorthologgen for dette gen er isoleret og er ikke forbundet med TRAM2, KSPO1 eller nogen anden Kris-defensiner, og der findes ingen Kris-defensiner i nærheden af anole TRAM2. To af de syv gener, der er forbundet med HPO1, har ortologer med et af de fem anolgener, der er forbundet med HPO1, men det kan ikke bestemmes i nogen af arterne, hvis disse er en del af resten af HPO-defensin-klyngen eller en del af en yderligere klynge. Slangeortologerne er forbundet med TRAM2, men er ikke en del af klyngen.
strukturel mangfoldighed
mangfoldighed kan ses i variationer i strukturen af det kurdiske forsvarsdomæne. Typisk består et Kris-defensin af 2-3 eksoner: et signalpeptid, en ekson med propiece og Kris-defensin-domæne med seks cysteiner, og i nogle tilfælde en kort tredje ekson. Variationer i antallet af Kris-defensin-domæner, eksonstørrelse, ekson-nummer, atypisk afstand mellem cysteiner og/eller antallet af cysteiner i det Kris-defensin-domæne kan findes i alle undersøgte reptilarter (upubliceret). Der er tre Kris-defensiner med to defensin-domæner (VkBD7, Vkbd34og VkBD43) og et med tre defensin-domæner (VkBD39). Komodo-dragen i Krishna-defensin-generne VkBD12, VkBD13 og VkBD14 og deres ortologer i anoler har atypisk store eksoner. Gruppen af forsvarere mellem vkbd16 og VkBD21 har også atypisk store eksoner. Atypisk afstand mellem cysteinrester findes i tre kurr-defensiner, VkBD20 (1-3-9-7), VkBD57 (3-4-8-5) og VkBD79 (3-10-16-6). Der er fire karrus-defensiner med yderligere cysteinrester i karrus-defensin-domænet: VkBD6 med 10 cysteinrester og en gruppe på tre kurr-defensiner, VkBD16, VkBD17 og VkBD18, med otte cysteinrester.
de to af vkbd7 ‘s Kris-defensin-domæner er homologe med vkbd8’ s ene Kris-defensin-domæner med ortologer i andre arter af Kvamata. I anole-firben A. carolinensis er der to ortologer, Lsd6 med et LSD-defensin-domæne og ikke-klyngen Lsd82 med to LSD-defensin-domæner. Orthologerne i slanger (SnBD5 og SnBD6) har et Krish-defensin domæne. VkBD34 er en ortholog af Lsbd39 i anoler og SnBD15 i slanger. VkBD39 og VkBD43 består af tre og to homologe hhv. VkBD40 er homologt med det andet ekson af lsbd52, Lsbd53, Lsbd54 (med et defensin-domæne) og Lsbd55.
en stigning i antallet af cysteiner i kurr-defensin-domænet resulterer i muligvis dannelse af yderligere disulfidbroer. Eksempler på denne variation kan findes i psittacine Kurt-defensin, Psittaciforme AvBD12 . Det ser ud til, at vkbd6 ‘ s domæne består af 10 cysteiner, hvoraf fire er en del af en forlængelse efter et typisk kurvforsvarsdomæne med et yderligere parret cystein (C-6-C-4-C-9-C-6-CC-7-C-7-CC-5-C). Gruppen af Komodo-Kris-defensiner VkBD16, VkBD17 og VkBD18 har ud over at have en atypisk cysteinafstand også otte cysteiner inden for et typisk antal rester. Det efter denne gruppe, vkbd19, er en paralog af disse tre gener; imidlertid indeholder det karrus-defensin-Domæne de mere typiske seks cysteinrester.
genstrukturerne af disse Komodo-Kurt-defensin-gener er underlagt bekræftelse med dokumentation. Der er en række atypiske strukturelementer i anole-firben inklusive yderligere ikke-Kurt-defensin-domæneekroner eller større eksoner.
analyser af peptidsekvenserne kodet af de nyligt identificerede Komodo-drage-Kurt-defensin-gener afslørede, at størstedelen (53 ud af 66) af dem forudsiges at have en nettopositiv ladning ved fysiologiske forhold, som det er typisk for denne klasse af antimikrobielt peptid (tabel 3). Det er imidlertid bemærkelsesværdigt, at fire peptider (vkbd10, VkBD28, VkBD30 og VkBD34) forudsiges at være svagt kationiske eller neutrale (+ 0,5–0) ved pH 7, mens ni peptider (vkbd3, VkBD4, VkBD11, VkBD19, VkBD23, VkBD26, VkBD35, VkBD36 og VkBD37) forudsiges at være svagt til stærkt anionisk. Disse fund antyder, at mens disse peptider udviser kanoniske karrus-defensin-strukturelle træk og befinder sig i karrus-defensin-genklynger, kan et eller flere af disse gener muligvis ikke kode for karrus-defensin-lignende peptider eller kanoniske karrus-defensiner, fordi karrus-defensiner typisk er kationiske, og deres positive ladning bidrager til deres antimikrobielle aktivitet.
identifikation af Komodo dragon ovodefensin-gener
Ovodefensin-gener er fundet i flere fugle-og krybdyrarter med ekspression fundet i æggehvide og andre væv. Ovodefensiner inklusive kyllingepeptidet gallin (Gallus gallus OvoDA1) har vist sig at have antimikrobiel aktivitet mod den Gram-negative E. coli og den Gram-positive S. aureus. Presumptive Kurt-ovodefensiner findes i en klynge i den samme synteniske blok som krit-defensin-klyngen hos fugle og krybdyr. Der har været 19 karrus-ovodefensiner fundet i A. carolinensis (en med et otte cystein-karrus-defensin-domæne) og fem i slanger (fire med et otte cystein-karrus-defensin-domæne) (Prickett, M. D., upubliceret igangværende arbejde). Komodo-drageklyngen består af seks karrus-ovodefensiner (Tabel 4 og 5). To af disse kan være Komodo dragon-specifikke; VkOVOD1, som er en pseudois en ortolog af SnOVOD1 ud over den første høns-ovodefensin i skildpadder og krokodiller. Defensin-domænerne VkOVOD3, Vkovod4og VkOVOD6 består af otte cysteiner, ortologer af henholdsvis SnOVOD2, Snovod3og SnOVOD5. VkOVOD4 og VkOVOD6 er ortologer af Lsovod14.
identifikation af Komodo-dragen cathelicidin-gener
Cathelcidin-peptidgener er for nylig blevet identificeret i krybdyr gennem genomiske tilgange . Flere cathelicidin peptidgener er blevet identificeret i fugle, slanger og anole firben . Frigivelsen af funktionelle cathelicidin antimikrobielle peptider er blevet observeret fra kylling heterofiler, hvilket antyder, at reptilian heterofiler også kan være en kilde til disse peptider . Alibardi et al. har identificeret cathelicidin peptider udtrykkes i anol firben væv, herunder forbundet med heterofiler . Cathelicidin antimikrobielle peptider menes at spille nøgleroller i medfødt immunitet hos andre dyr og spiller sandsynligvis også denne rolle i Komodo-dragen.
i anol-firben er cathelicidin-genklyngen, der består af 4 gener, organiseret som følger: < FASTK>cathelicidin-klynge <KLHL18>. Vi søgte efter en lignende cathelicidin-klynge i Komodo dragon-genomet. Søgning i Komodo dragon-genomet efter cathelicidin-lignende gener afslørede en klynge af tre gener, der har et “cathelin-lignende domæne”, hvilket er det første krav til et cathelicidingen, der er placeret i den ene ende af saffold 84. Denne region af stillads 84 har imidlertid samlingsproblemer med huller, isolerede eksoner og duplikationer. Identificerede Komodo dragon cathelicidin-gener er opkaldt efter deres anolortologer. To af Komodo dragon cathelicidins (Cathelicidin2 og Cathelicidin4.1) er i sektioner uden samlingsproblemer. I modsætning hertil blev Cathlicidin4.2 konstrueret ved hjælp af et forskelligt sæt eksoner 1-3 og en forkert placeret ekson 4 for at skabe et komplet gen, som er paralogisk for Cathelicidin4.1. Da klyngen findes i den ene ende af stilladset, kan der være yderligere uidentificerede katelicidiner, der ikke er fanget i denne samling.
et fælles træk ved cathelicidin antimikrobielle peptidgensekvenser er, at det N-terminale Katelin-domæne koder for mindst 4 cysteiner. I vores undersøgelse af alligator-og slangekatelicidiner bemærkede vi også, at typisk efter den sidste cystein, et tre-restmønster bestående af VRR eller lignende sekvens går umiddelbart forud for det forudsagte C-terminale kationiske antimikrobielle peptid . Yderligere krav til en cathelicidin antimikrobiel peptidgensekvens er, at den koder for et nettopositivt ladet peptid i den C-terminale region, det er typisk kodet af den fjerde ekson, og det er typisk cirka 35 aa i længden (interval 25-37) . Da den naturligt forekommende protease, der er ansvarlig for spaltning og frigivelse af de funktionelle antimikrobielle peptider, ikke er kendt, er forudsigelse af det nøjagtige spaltningssted vanskeligt. Som det kan ses i tabel 6, er de forudsagte aminosyresekvenser for hver af de identificerede komodo dragon cathelicidin-genkandidater anført. Udfører vores Analyse på hver sekvens, vi lavede forudsigelser og konklusioner om, hvorvidt hvert potentielt cathelicidingen kan kode for et antimikrobielt peptid.
det kan ses, at den forudsagte N-terminale proteinsekvens af Cathelicidin2_VARKO (VK-CATH2) indeholder fire cysteiner (understreget, Tabel 6). Der er imidlertid ikke en åbenbar “VRR” eller lignende sekvens i ~ 10 aminosyrerne efter den sidste cysteinrest, som vi så i alligator og relaterede cathelicidinsekvenser . Derudover afslører analyse af de 35 C-terminale aminosyrer en forudsagt peptidsekvens, der mangler en nettopositiv ladning. Af disse grunde forudsiger vi, at Cathelicidin2_VARKO-gensekvensen ikke koder for et aktivt cathelicidin antimikrobielt peptid ved dets C-terminal (Tabel 7).
for det identificerede Cathelicidin4 .1_varko-gen inkluderer det forudsagte cathelin-Domæne de nødvendige fire cysteinrester (Tabel 6), og sekvensen “VTR” er til stede inden for 10 aminosyrer fra den sidste cystein, svarende til “VRR” – sekvensen i alligator cathelicidingenet. Det 33-aa C-terminale peptid efter “VTR” – sekvensen forudsiges at have en netto + 12-Ladning ved fysiologisk pH, og en stor del af sekvensen forudsiges at være spiralformet , hvilket er i overensstemmelse med cathelicidiner. Størstedelen af kendte cathelicidiner indeholder segmenter med signifikant spiralformet struktur . Endelig indikerer analyse af sekvensen ved anvendelse af den antimikrobielle Peptiddatabase, at peptidet potentielt er et kationisk antimikrobielt peptid . Derfor forudsiger vi, at dette gen sandsynligvis koder for et aktivt cathelicidin antimikrobielt peptid, kaldet VK-CATH4.1 (Tabel 7).
derudover demonstrerer dette peptid en vis homologi med andre kendte antimikrobielle peptider i den antimikrobielle Peptiddatabase (tabel 8). Det viser en særlig høj grad af sekvenslighed med cathelicidinpeptider identificeret fra kvamater, med eksempler inkluderet i tabel 8. Således har det forudsagte VK-CATH4.1-peptid mange af kendetegnene for et cathelicidin-peptid og er en stærk kandidat til yderligere undersøgelse. Tabel 8 viser justeringen af VK_CATH4 .1 med kendte peptider i den antimikrobielle Peptiddatabase.
for det identificerede Cathelicidin4.2_varko-gen inkluderer det forudsagte cathelindomæne de nødvendige fire cysteinrester (Tabel 6). Som det blev bemærket i Cathelicidin4.1_varko-genet, er sekvensen “VTR” til stede inden for 10 aminosyrer i den fjerde cysteinrest og går umiddelbart forud for det C-terminale segment, som koder for et 30-aa-peptid, der forudsiges at være antimikrobielt . Aminosyresekvensen af det C-terminale peptid forudsiges at have en netto + 10-ladning ved fysiologisk pH, og det demonstrerer forskellige grader af homologi til andre kendte antimikrobielle peptider i den antimikrobielle Peptiddatabase . Således udviser dette kandidatpeptid ligesom VK-CATH4.1 også mange af kendetegnene forbundet med cathelicidinpeptider og er en anden stærk kandidat til videre undersøgelse. Tabel 8 viser homologien og tilpasningen af VK-CATH4.2 med kendte peptider fra den antimikrobielle Peptiddatabase. Endelig findes gensekvensen, der koder for det funktionelle peptid VK-CATH4.2, på ekson 4, som er den typiske placering af det aktive cathelicidinpeptid. Denne ekson koder for peptidsekvensen LDRVTRRRRFFKAKRFVKRHGVSIAVGAYRIIG.
det forudsagte peptid VK-CATH4.2 er meget homolog med peptider fra andre forudsagte cathelicidingener med lignende forudsagte C-terminale peptider fra A. carolinensis, G. japonicus og P. bivittatus (tabel 8). Rester 2-27 af VK-CATH4.2 er 65% identiske og 80% ligner anolkatelicidin – 2 som forudsagt C-terminalt peptid (008116755.1, aa 130-155). Restkoncentrationer 2-30 af VK-CATH4.2 er 66% identiske og 82% svarer til det Gecko Cathelicidin-relaterede forudsagte C-terminale peptid (015277841.1, aa 129-151). Endelig er aa 2-24 af VK-CATH4.2 57% identiske og 73% svarende til det Cathelicidin-relaterede OH-CATH-lignende forudsagte C-terminale peptid (007445036.1, aa 129-151).