solutyypit Komodonvaraanin veressä
verinäyte saatiin Tujah-nimisestä Komodonvaraanista Saint Augustinen Alligaattorifarmin eläintieteellisessä puistossa vaadittujen turvallisuus-ja sääntelymenettelyjen ja asianmukaisten hyväksyntöjen mukaisesti.. Keräämisen aikaan olimme kiinnostuneita keräämään sekä genomista DNA: ta sekvensointia varten että mRNA: ta cDNA-kirjaston luomiseksi proteomisten tutkimusten helpottamiseksi. Linnuilla heterofiilien (valkosolujen) tiedetään ilmaisevan useita antimikrobisia peptidejä . Kanan heterofiileistä tunnistetuilla antimikrobisilla peptideillä on merkittäviä antimikrobisia ja isäntäohjautuvia immunomodulatorisia vaikutuksia . Niinpä otettuamme ensimmäisen näytteen tuoreesta Komodo-Lohikäärmeen verestä, annoimme valkosolujen laskeutua verestä ja keräsimme ne, koska ne todennäköisesti liittyivät antimikrobiseen peptidiekspressioon. Kerätyt Komodo Dragonin valkosolut jaettiin sitten tasaisesti, ja puolet käsiteltiin genomisen DNA: n eristämiseen valmisteltaessa sekvensointia ja kirjastosukeltamista, ja toinen puoli varattiin mRNA: n erottamiseen proteomisia tutkimuksiamme varten.
tämän jälkeen teimme seulontoja ja tunnistimme havaitsemamme eri solutyypit. Immuunisolutunnistus Komodon lohikäärmeen veressä on haastavaa, koska referenssikirjallisuus on rajallista. Eri solutyypit, joita havaittiin Wright-värjätyissä veritahroissa, on esitetty Fig: ssä. 2. Tunnistimme nämä solut samankaltaisuuden perusteella kuin aiemmin tunnistamamme immuunisolut amerikkalaisen alligaattorin veressä . Kiinnostavia olivat tämän matelijan suuret ja pitkänomaiset tumalliset punasolut. Lisäksi pystyimme tunnistamaan heterofiilit (samanlaisia kuin granulosyytit), katelisidiinipeptidien todennäköisen lähteen sekä monosyytti-ja lymfosyyttisolut.
Komodonvaraani punasoluja ja immuunisoluja. Verisolut Komodo dragon visualisoitiin Wright stain ja imaged at 40x. Cell tyypit tunnistetaan: A. nukleated punasolu, B. monocyte, C. lymfocyte, ja D. heterophil
toinen komodonlohikäärmeen verinäyte kerättiin myöhemmin ja käsiteltiin genomisen DNA: n erottamista varten Lohenpyrstögenomiikan avulla lisäsekvenssiä varten. Dovetail Genomicsin tutkijat eivät erottaneet valkosoluja, vaan eristivät DNA: ta suoraan kokoverestä pelletoiduista soluista.
Komodo-Lohikäärmeen genomin kokoaminen ja merkitseminen
Komodo-Lohikäärmeen erytrosyyttejä koskevat aiemmat analyysit virtaussytometriaa käyttäen arvioivat genomin olevan noin 1, 93 Gb: n kokoinen . Käyttämällä syvä Illumina sekvensointi ja sovittaa lähestymistapoja, saimme luonnos genomi kokoonpano, joka oli 1.60 Gb suuri, samanlainen genomin koko A. carolinensis lizard genomi, joka on 1.78 Gb . Luonnos kokoonpano sisältää 67,605 telineet N50 23.2 Mb (Taulukko 1). Kaikkiaan ennustettiin 17 213 geeniä, joista 16 757 (97,35%) merkittiin. Cegma: n täydellisyysarviot olivat 56 prosenttia (”täydellinen”) ja 94 prosenttia (”osittainen”). Arvioitu toistojen osuus perimässä on 35,05% ja suurin osa on LINEs (38,4%) ja SINEs (5,56%) (Lisätiedosto 1: Fig. S1 & lisätiedosto 2: taulukko S1). Genomitiedot ovat saatavilla NCBI raw sekvensointi lukee talletettu sekvenssi lukea arkisto (#SRP161190), ja genomi kokoonpano DDBJ / ENA / GenBank liittymisen #VEXN00000000. Tässä asiakirjassa kuvattu kokoonpanoversio on VEXN01000000.
mahdollisten synnynnäisten immuniteettien ja antimikrobisten peptidigeenien
synnynnäisen immuniteetin tunnistaminen matelijoilla on kriittinen näkökohta niiden evolutiivisen menestyksen kannalta, mutta se on edelleen huonosti ymmärretty näillä eläimillä. Synnynnäisellä immuniteetilla tarkoitetaan niitä immuniteetin osa-alueita, jotka eivät ole vasta-aineita eivätkä T-soluja. Synnynnäisiä immuunivasteita hyökkääville patogeeneille voivat olla sytokiinien ilmentyminen, makrofagien, leukosyyttien ja muiden valkosolujen aktivoituminen ja rekrytointi sekä antimikrobisten peptidien, kuten defensiinien ja katelisidiinien, ilmentyminen .
tässä työssä on käytetty genomipohjaista lähestymistapaa Komodon Lohikäärmeen genomin synnynnäisten immuniteettigeenien tunnistamiseen. Olemme sekvensoineet Komodon genomin ja tutkineet siitä geenejä ja rykelmiä tärkeitä synnynnäisiä mikrobilääkkeiden peptidigeenejä (β-defensiinit, ovodefensiinit ja katelisidiinit), jotka todennäköisesti osallistuvat tämän jättiläisliskon synnynnäisen immuniteetin ilmentymiin.
β-Defensiini ja siihen liittyvät geenit Komodon genomissa
Defensiinit ovat yksi esimerkki disulfidistabiloiduista antimikrobisista peptideistä, ja β-defensiinit ovat ainutlaatuisen selkärankaisen perheen disulfidistabiloituja, kationisia antimikrobisia peptidejä, jotka osallistuvat resistenssiin mikrobien kolonisaatiolle epiteelipinnoilla . Β-defensiinipeptidit määritellään ominaisella kuusikysteiinimotiivilla, jonka kysteiinijäämien väli on säilynyt (C-X6–C–X (3-5)–C–X (8-10)–C-X6-CC) ja siihen liittyvällä disulfidisidoskuviolla (Cys1-Cys5, Cys2-Cys4 ja Cys3-Cys6); kuitenkin kysteiinijäämien määrässä ja väleissä on havaittu eroja. Kuten muillakin kationisilla antimikrobisilla peptideillä, β-defensiineillä on tyypillisesti positiivinen nettovaraus (kationinen, emäksinen).
yksi ensimmäisistä laajoista raporteista β-defensiinipeptidin in vivo-roolista matelijoissa on β-defensiinien indusoituva ilmentyminen haavoittuneissa anoliliskoissa (Anolis carolinensis) . Matelijoiden neutrofiileissa näyttää olevan rakeita, jotka sisältävät sekä katelisidiinin kaltaisia peptidejä että β-defensiinipeptidejä. β-defensiinin kaltaisia peptidejä on myös matelijoiden munissa . On tunnettua, että jotkut liskolajit voivat menettää häntänsä saalistajien pakokeinona, ja että nämä hännät sitten uusiutuvat haavasta ilman tulehdusta tai infektiota. β-defensiinipeptidejä ilmenee sekä haavapohjan atsurofiilisissa granulosyyteissä että siihen liittyvässä epiteelissä, ja niitä havaitaan hajoavia bakteereja sisältävissä fagosomeissa. On olemassa selvä puute tulehdus haavan, joka liittyy uudistumista, ja kaksi β-defensins erityisesti ilmaistaan suurina pitoisuuksina parantumiskudoksissa yleisesti, näyttää olevan merkittävä rooli β-defensins haavan paranemista ja uudistumista anolilisko .
β-defensiinigeenien on yleensä havaittu asuvan klustereissa selkärankaisten genomien sisällä . Ihmisillä tunnistettiin peräti 33 β-defensiinigeeniä viidessä ryppäässä . Hiljattain useiden lintulajien, kuten ankan, seeprapeipon ja kanan, genomien analyysit paljastivat, että kunkin lajin perimässä oli β-defensiiniklusteri . Anoliliskosta (Prickett, M. D., julkaisematon teos) on hiljattain löydetty β-defensiinin kaltainen geenijoukko, joka on läheistä sukua Komodonvaraanille . Mielenkiintoista on, että katepsiini B-geeni (CTSB) on tunnistettu vahvaksi merkkiaineeksi β-defensiiniklustereille ihmisillä, hiirillä ja kanoilla . Niinpä tutkimme katepsiini B-geenin (CTSB) Komodon genomia mahdollisena markkerina, joka auttaa siinä olevan β-defensiiniklusterin (- ryhmien) tunnistamisessa.
näiden analyysien avulla tunnistimme yhteensä 66 potentiaalista β-defensiinigeeniä Komodo dragon genomissa, joista 18: n arvellaan olevan Komodo dragon-spesifisiä β-defensiinigeenejä (Taulukko 2). Komodo Dragonin genomista tunnistetuissa β-defensiinigeeneissä esiintyy muutoksia kysteiinivälissä, geenin koossa, β-defensiinidomeenin muodostavien kysteiinijäämien määrässä sekä β-defensiinidomeenien määrässä. Mitä tulee säilyneiden kysteiinijäämien etäisyyteen, erityisesti lopussa (C–X6–C–X (3-5)–C–X (8-10)–C–X6–CC), havaitsimme huomattavaa vaihtelua Komodo dragon genomin β-defensiinigeenien analyysissämme, sillä viidessä Komodo dragon β-defensiinigeenissä on seitsemän viimeisten kysteiinien välissä, 16: ssa kuusi jäämää viimeisten kysteiinien välissä, 42: ssa viisi jäämää viimeisten kysteiinien välillä ja kolmessa Komodo dragon β-defensiinissä geeneissä esiintyy monimutkaisempia kysteiini-jäämien välejä kuvaavia kuvioita (taulukko 2).
kuten linnuilla ja muilla matelijoilla, suurin osa Komodonvaraani-defensiinigeeneistä näyttää asuvan kahdessa erillisessä rykelmässä saman synteenisen lohkon sisällä (kuva. 3). Yksi klusteri on β-ovodefensiiniklusteri, jota reunustaa toisessa päässä XK-geeni, Kell-veriryhmäkompleksin alayksikköön liittyvä geeni 6 (XKR6) ja toisessa päässä Myotubulariinin sukulaisproteiini 9 (MTMR9). Intercluster alueella noin 400,000 bp sisältää geenit perheen kanssa sekvenssin samankaltaisuus 167, jäsen a (FAM167A); BLK proto-onkogeeni, Src perheen tyrosiinikinaasi (BLK); Farnesyyli-difosfaatti farnesyylitransferaasi 1 (FDFT1); ja CTSB (katepsiini B), joka on rinnalla geeni β-defensiini klusterin (Fig. 3). Linnuilla, kilpikonnilla ja krokotiileilla β-defensiiniklusterin toista päätä seuraa Translokaatioon liittyvä geeni membraaniproteiini 2 (TRAM2). Kuten kaikkien muidenkin tutkittujen sklamaatti-(liskojen ja käärmeiden) genomien kohdalla, β-defensiiniklusterin lopun sivugeeniä ei voida tällä hetkellä lopullisesti määrittää, koska ei ole olemassa sqamate-genomeja, joissa olisi ehjät klusterit.
β-defensiinin geeniperheklusterit. Tunnistettujen Komodonvaraani-defensiini-ja ovodefensiinigeenien rakennustelinepaikat korostaen defensiini-ja ovodefensiiniklustereita Komodonvaraani-genomissa
klusterin päässä saattoi olla joko xpo1 tai TRAM2 tai ei kumpikaan. Kaksi kolmesta geenistä löytyy scaffold 45 kanssa TRAM2 (VkBD80a, VkBD80b) ovat lähes identtisiä ja mahdollisesti tuloksena kokoonpano artefakti. Geenit ovat avian, kilpikonnan ja crocodilian β-defensiiniklusterien viimeisen geenin ortologeja. Tämän geenin anoliortologiaei ole eristetty eikä se liity TRAM2: een, XPO1: een eikä muihin β-defensiineihin, eikä anolin tram2: n läheisyydestä löydy β-defensiinejä. Kahdella seitsemästä XPO1: een liittyvästä geenistä on ortologia, jossa on yksi xpo1: een liittyvistä viidestä anoligeenistä, mutta sitä ei voida määrittää kummallakaan lajilla, ovatko nämä osa muuta β-defensiiniklusteria vai osa ylimääräistä klusteria. Käärmeen ortologit liittyvät TRAM2: een, mutta eivät kuulu klusiiliin.
rakenteellinen monimuotoisuus
moninaisuus näkyy β-defensiinin alueen rakenteen vaihteluna. Tyypillisesti β-defensiini koostuu 2-3 eksonista: signaalipeptidistä, eksonista propeenin kanssa ja β-defensiinin domeenista, jossa on kuusi kysteiiniä, ja joissakin tapauksissa lyhyestä kolmannesta eksonista. Kaikilla tutkituilla matelijalajeilla esiintyy vaihtelua β-defensiini-domeenien määrässä, eksonikoossa, eksoniluvussa, kysteiinien epätyypillisessä välissä ja/tai kysteiinien määrässä β-defensiini-domeenissa (julkaisematon). On olemassa kolme β-defensiiniä, joissa on kaksi defensiinitunnusta (VkBD7, VkBD34 ja VkBD43) ja yksi, jossa on kolme defensiinitunnusta (VkBD39). Komodo dragon β-defensiinin geeneissä VkBD12, VkBD13 ja VkBD14 ja niiden ortologeissa anoleissa on atyypillisesti suuria eksoneja. Vkbd16: n ja VkBD21: n välisellä β-defensiinien ryhmällä on myös atyyppisesti suuria eksoneja. Epätyypillinen välimatka kysteiinijäämien välillä on kolmessa β-defensiinissä, VkBD20 (1-3-9-7), VkBD57 (3-4-8-5) ja VkBD79 (3-10-16-6). Β-defensiini-domeenissa on neljä β-defensiiniä, joissa on ylimääräisiä kysteiinijäämiä: VkBD6, jossa on 10 kysteiinijäämää, ja ryhmä kolmea β-defensiiniä, VkBD16, VkBD17 ja vkbd18, joissa on kahdeksan kysteiinijäämää.
vkbd7: n kaksi β-defensiinialuetta ovat homologisia VkBD8: n yhden β-defensiinialueen kanssa ortologien kanssa muissa Squamata-lajeissa. Anoliliskossa A. carolinensis on kaksi ortologiaa, LzBD6, jossa on yksi β-defensiinidomeeni ja lzbd82, jossa on kaksi β-defensiinidomeenia. Käärmeiden ortologeilla (SnBD5 ja SnBD6) on yksi β-defensiini-domeeni. VkBD34 on Anolien LzBD39: n ja käärmeiden SnBD15: n ortoggi. VkBD39 ja VkBD43 koostuvat kolmesta ja kahdesta homologisesta β-defensiinin verkkotunnuksesta, jotka ovat homologisia LzBD52: n, LzBD53: n ja LzBD55: n kolmansiin eksoneihin nähden, joissa kaikissa on kaksi ei-homologista β-defensiinin verkkotunnusta. VkBD40, jossa on yksi β-defensiinitunnus, on homologinen seuraavien eksonien kanssa: LzBD52, LzBD53, LzBD54 (jossa on yksi defensiinitunnus) ja LzBD55.
kysteiinien määrän lisääntyminen β-defensiinialueella johtaa mahdollisesti uusien disulfidisiltojen muodostumiseen. Esimerkkejä tästä vaihtelusta löytyy psittacine β-defensiinistä, Psittaciforme AvBD12 . VkBD6: n β-defensiini-verkkotunnus näyttää koostuvan 10 kysteiinistä, joista neljä on osa laajennusta tyypillisen β-defensiini-verkkotunnuksen jälkeen, ja lisäksi on paritettu kysteiini (C-X6-C-X4-C-X9-C-X6-CC-X7-C-X7-CC-X5-C). Komodo β-defensiinien ryhmässä VkBD16, VkBD17 ja VkBD18 on epätyypillisen kysteiinivälin lisäksi kahdeksan kysteiiniä tyypillisessä jäämämäärässä. Tätä ryhmää seuraava β-defensiini, VkBD19, on näiden kolmen geenin paralogi; β-defensiini-domeeni sisältää kuitenkin tyypillisemmät kuusi kysteiinijäämää.
näiden Komodo β-defensiinigeenien geenirakenteet on vahvistettava asiaa tukevalla todistusaineistolla. Anoliliskoissa on useita epätyypillisiä rakenneosia, mukaan lukien muita kuin β-defensiinidomeenin eksoneja tai suurempia eksoneja.
vasta tunnistettujen Komodo dragon β-defensiinigeenien koodaamien peptidisekvenssien analyysit osoittivat, että suurimmalla osalla (53: lla 66: sta) niistä ennustetaan olevan positiivinen nettovaraus fysiologisissa olosuhteissa, mikä on tyypillistä tälle mikrobilääkepeptidiryhmälle (Taulukko 3). On kuitenkin huomattava, että neljän peptidin (VkBD10, VkBD28, VkBD30 ja VkBD34) ennustetaan olevan heikosti kationisia tai neutraaleja (+ 0,5–0) pH 7: ssä, kun taas yhdeksän peptidin (VkBD3, VkBD4, VkBD11, VkBD19, VkBD23, VkBD26, VkBD35, VkBD36 ja VkBD37) ennustetaan olevan heikosti tai voimakkaasti anionisia. Nämä havainnot viittaavat siihen, että vaikka näillä peptideillä on kanonisia β-defensiinin rakenteellisia ominaisuuksia ja ne sijaitsevat β-defensiinin geeniklustereissa, yksi tai useampi näistä geeneistä ei välttämättä koodaa β-defensiinin kaltaisille peptideille tai kanonisille β-defensiineille, koska β-defensiinit ovat tyypillisesti kationisia ja niiden positiivinen varaus edistää niiden antimikrobista aktiivisuutta.
Komodonvaraani ovodefensiini-geenit
Ovodefensiini-geenit on tunnistettu useilla lintu-ja matelijalajeilla , ja ilmentymä löytyy munanvalkuaisesta ja muista kudoksista. Ovodefensiineillä, mukaan lukien kanapeptidi gallin (Gallus gallus OvoDA1), on osoitettu olevan antimikrobista vaikutusta Gramnegatiivista E. coli-bakteeria ja Grampositiivista S. aureus-bakteeria vastaan. Oletettuja β-ovodefensiineja on ryppäässä samassa synteenisessä lohkossa kuin lintujen ja matelijoiden β-defensiiniryhmässä. A. carolinensiksesta on löydetty 19 β-ovodefensiiniä (yksi, jossa on kahdeksan kysteiini β-defensiini-domeenia) ja viisi käärmeistä (neljä, joissa on kahdeksan kysteiini β-defensiini-domeenia) (Prickett, M. D., julkaisematon työ kesken). Komodon lohikäärmeklusteri koostuu kuudesta β-ovodefensiinistä (taulukot 4 ja 5). Kaksi näistä voi olla Komodo dragon specific; VkOVOD1, joka on pseudois ortolog SnOVOD1 lisäksi ensimmäinen β-ovodefensiini kilpikonnia ja krokotiileja. Defensiinin domeenit VkOVOD3, VkOVOD4 ja VkOVOD6 koostuvat kahdeksasta kysteiinistä, ortologeista SnOVOD2, SnOVOD3 ja SnOVOD5. VkOVOD4 ja VkOVOD6 ovat LzOVOD14: n ortologeja.
Komodon lohikäärmekatelisidiinigeenien
Katelsidiinipeptidigeenit on hiljattain tunnistettu matelijoilla genomiikan keinoin . Linnuista , käärmeistä ja anoliliskosta on tunnistettu useita katelisidiinipeptidigeenejä . Kanojen heterofiileistä on havaittu vapautuvan toiminnallisia katelisidiinin antimikrobisia peptidejä, mikä viittaa siihen, että matelijoiden heterofiilit voivat olla myös näiden peptidien lähde . Alibardi ym. on tunnistettu katelisidiinipeptidejä, joita esiintyy anoliliskon kudoksissa, mukaan lukien heterofiileihin liittyvät. Katelisidiinin antimikrobisilla peptideillä uskotaan olevan keskeinen rooli muiden eläinten synnynnäisessä immuniteetissa, joten niillä on todennäköisesti sama rooli myös Komodonvaraanissa.
anoliliskoilla 4 geenistä koostuva katelisidiinigeeniklusteri on järjestetty seuraavasti: <FASTK> katelisidiiniklusteri <KLHL18>. Etsimme samanlaista katelisidiiniklusteria Komodon Lohikäärmeen genomista. Katelisidiinin kaltaisten geenien etsiminen Komodon Lohikäärmeen genomista paljasti kolmen geenin rykelmän, jolla on ”kateliinin kaltainen domeeni”, joka on saffold 84: n toisessa päässä sijaitsevan katelisidiinigeenin ensimmäinen vaatimus. Tällä scaffold 84: n alueella on kuitenkin kokoonpano-ongelmia, joissa on aukkoja, yksittäisiä eksoneja ja päällekkäisyyksiä. Tunnistetut Komodon lohikäärmekatelisidiinigeenit on nimetty niiden anoliortologien mukaan. Kaksi Komodon lohikäärmekatelisidiineista (Katelisidiini2 ja Katelisidiini4.1) ovat sektioissa, joilla ei ole kokoonpanoongelmia. Sen sijaan Katlisidiini4.2 konstruoitiin erilaisten eksonien 1-3 ja eksonin 4 avulla täydellisen geenin luomiseksi, joka on katelisidiini4.1 halvaannuttava. Koska Rykelmä löytyy telineen toisesta päästä, voi löytyä lisää tunnistamattomia katelisidiinejä, joita ei ole vangittu tähän kokoonpanoon.
katelisidiinin antimikrobisten peptidigeenisekvenssien yhteinen piirre on, että N-terminaalinen kateliinidomeeni koodaa vähintään 4 kysteiiniä. Alligaattori-ja käärmekatelisidiinitutkimuksessamme huomasimme myös, että tyypillisesti viimeisen kysteiinin jälkeen kolmijäämäkuvio, joka koostuu VRR: stä tai vastaavasta sekvenssistä, edeltää välittömästi ennustettua C-terminaalista kationista koostuvaa antimikrobista peptidiä . Katelisidiinin antimikrobisen peptidin geenisekvenssin lisävaatimukset ovat, että se koodaa nettopositiivista varautunutta peptidiä C-terminaalialueella, se koodataan tyypillisesti neljännellä eksonilla ja sen pituus on tyypillisesti noin 35 aa (vaihteluväli 25-37) . Koska funktionaalisten antimikrobisten peptidien pilkkoutumisesta ja vapautumisesta vastaavaa luonnossa esiintyvää proteaasia ei tunneta, tarkan pilkkoutumiskohdan ennustaminen on vaikeaa. Kuten taulukosta 6 käy ilmi, on lueteltu kunkin tunnistetun Komodonvaraanikatelisidiinigeenin ennustetut aminohapposekvenssit. Analysoidessamme jokaista sekvenssiä teimme ennusteita ja johtopäätöksiä siitä, voiko jokainen mahdollinen katelisidiinigeeni koodata antimikrobista peptidiä.
voidaan nähdä, että katelisidiini2_varkon (VK-CATH2) ennustettu n-terminaalinen proteiinijakso sisältää neljä kysteiiniä (alleviivattu, Taulukko 6). Kuitenkin, ei ole selvää ”VRR” tai vastaavaa sekvenssi ~ 10 aminohapot seuraavat viimeinen kysteiini jäännös kuten näimme alligaattori ja siihen liittyvät katelisidiini sekvenssit . Lisäksi 35 C-terminaalisen aminohapon analyysi paljastaa ennustetun peptidisekvenssin, josta puuttuu positiivinen nettovaraus. Näistä syistä ennustamme, että Katelisidiini2_varko-geenisekvenssi ei koodaa aktiiviselle katelisidiinin antimikrobiselle peptidille sen C-terminuksessa (Taulukko 7).
tunnistetulle Katelisidiini4. 1_varko-geenille ennustettu kateliini-domeeni sisältää tarvittavat neljä kysteiinijäämää (Taulukko 6), ja sekvenssi ”VTR” on läsnä viimeisen kysteiinin 10 aminohapossa, samanlainen kuin alligaattorin katelisidiinigeenin ”VRR” – sekvenssi . ”VTR”-sekvenssiä seuraavan 33-aa C-terminaalisen peptidin nettovarauksen ennustetaan olevan + 12 fysiologisessa pH: ssa, ja suuren osan sekvenssistä ennustetaan olevan kierteinen , mikä on katelisidiinien mukaista. Suurin osa tunnetuista katelisidiineistä sisältää segmenttejä, joilla on merkittävä kierteinen rakenne . Lopuksi sekvenssin analysointi antimikrobisen Peptiditietokannan avulla osoittaa, että peptidi on mahdollisesti kationinen antimikrobinen peptidi . Siksi ennustamme, että tämä geeni todennäköisesti koodaa aktiivista katelisidiinin antimikrobista peptidiä, jota kutsutaan VK-CATH4.1: ksi (Taulukko 7).
lisäksi tämä peptidi osoittaa jonkin verran homologiaa muille tunnetuille antimikrobisille peptideille antimikrobisessa Peptiditietokannassa (taulukko 8). Se osoittaa erityisen paljon sekvenssin samankaltaisuutta squamaateista tunnistettuihin katelisidiinipeptideihin, joista on esimerkkejä taulukossa 8. Näin ollen ennustetulla VK-CATH4.1-peptidillä on monia katelisidiinipeptidin tunnusmerkkejä ja se on vahva ehdokas jatkotutkimukseen. Taulukossa 8 esitetään vk_cath4.1: n linjaus antimikrobisen Peptiditietokannan tunnettujen peptidien kanssa .
tunnistetulle Katelisidiini4. 2_varko-geenille ennustettu kateliinidomeeni sisältää vaadittavat neljä kysteiinijäämää (Taulukko 6). Kuten todettiin Katelisidiini4. 1_varko-geenissä, sekvenssi ”VTR” on läsnä neljännen kysteiinijäämän 10 aminohapossa ja välittömästi edeltää C-terminaalista segmenttiä, joka koodaa 30-aa-peptidille, jonka ennustetaan olevan antimikrobinen . C-terminaalisen peptidin aminohappojärjestyksen ennustetaan olevan netto + 10-varaus fysiologisessa pH: ssa, ja se osoittaa vaihtelevaa homologiaa muille tunnetuille antimikrobisille peptideille antimikrobisessa Peptiditietokannassa . Näin ollen, kuten VK-CATH4.1: ssä, myös tällä ehdokaspeptidillä on monia katelisidiinipeptideihin liittyviä tunnusmerkkejä, ja se on toinen vahva ehdokas jatkotutkimukseen. Taulukossa 8 esitetään Vk-CATH4.2: n homologia ja linjaus antimikrobisen Peptiditietokannan tunnettujen peptidien kanssa. Lopuksi funktionaalista peptidiä VK-CATH4.2 koodaava geenisekvenssi löytyy eksonista 4, joka on aktiivisen katelisidiinipeptidin tyypillinen sijainti. Tämä eksoni koodaa peptidisekvenssin LDRVTRRRWRFFQKAKRFVKRHGVSIAVGAYRIIG.
ennustettu peptidi VK-CATH4. 2 on erittäin homologinen muiden ennustettujen katelisidiinigeenien peptidien kanssa, joilla on samanlaisia ennustettuja C-terminaalisia peptidejä A. carolinensikselta, G. japonicukselta ja P. bivittatukselta (taulukko 8). VK-KAT4: n jäämät 2-27.2 ovat 65% identtisiä ja 80% samanlaisia kuin anolikatelisidin-2 kuten ennustettu C-terminaalinen peptidi (XP_008116755.1, aa 130-155). VK-KAT4.2: n jäämät 2-30 ovat 66% samanlaisia ja 82% samanlaisia kuin Gekko-Katelisidiiniin liittyvä ennustettu C-terminaalinen peptidi (XP_015277841.1, aa 129-151). Lopulta VK-CATH4.2: n aa 2-24 on 57% identtinen ja 73% samanlainen kuin Katelisidiinin kaltainen Oh-Kathin kaltainen ennustettu C-terminaalinen peptidi (XP_007445036.1, aa 129-151).