コモドドラゴン血液中の細胞型
必要な安全性と規制手順に従い、適切な承認を得て、セントオーガスティンワニ農場動物園のTujahという名前のコモドドラゴンから血液のサンプルを得た。 収集時には、配列決定のためのゲノムDNAと、プロテオーム研究を容易にするためのcDNAライブラリーを生成するためのmRNAの両方を収集することに興味があ 鳥類では、ヘテロ球（白血球）は複数の抗菌ペプチドを発現することが知られている。 ニワトリのヘテロフィルから同定された抗菌ペプチドは、有意な抗菌および宿主指向の免疫調節活性を示す。 したがって、新鮮なコモドドラゴン血の最初のサンプルを得た後、我々は白血球を血液から沈降させ、抗菌ペプチド発現に関与する可能性が高いため、それらを収集した。 収集したコモドドラゴン白血球は均等に分割され、半分はシーケンシングとライブラリ生成の準備のためにゲノムDNAの単離のために処理され、残りの半分はプロテオーム研究のためのmRNA抽出のために予約された。
その後、塗抹標本を行い、観察した様々な細胞型を同定した。 コモドドラゴン血中の免疫細胞の同定は、参照のための限られた出版された文献のために挑戦的である。 Ｗｒｉｇｈｔ染色血液塗抹標本で観察された種々の細胞型を図１ ０に示す。 2. 我々は、以前にアメリカのワニの血で同定した免疫細胞との類似性に基づいて、これらの細胞を同定した。 興味深いのは、この爬虫類の大きくて細長い有核赤血球であった。 さらに、カテリシジンペプチドの可能性のある供給源であるヘテロフィル（顆粒球に似ている）、単球およびリンパ球細胞を同定することができた。
コモドドラゴン赤血球と免疫細胞。 コモドドラゴンからの血液細胞は、ライト染色によって可視化され、40xでイメージングされた。
コモドドラゴンの血液の第二のサンプルは、後に収集され、追加の配列決定のためのありゲノミクスによってゲノムDNA抽出のために処理されました。 Dovetail Genomicsの研究者は、白血球を分離せず、代わりに全血から直接ペレット化された細胞からDNAを抽出しました。
コモドドラゴンゲノムの組み立てと注釈
フローサイトメトリーを用いたコモドドラゴン赤血球の以前の分析では、ゲノムの大きさは約1.93Gbと推定されていた。 深いイルミナシーケンシングとありのアプローチを使用して、我々は1.60GbであるA.carolinensisトカゲゲノムのゲノムサイズに似た1.78Gbの大きなだったドラフトゲノムアセンブリを得た。 ドラフトアセンブリには67,605個の足場が含まれており、N50は23.2Mbです（表1）。 合計17,213個の遺伝子が予測され、そのうち16,757個（97.35％）が注釈された。 CEGMAによる完全性の推定値は、56％（”完全”）および94％（”部分的”）であった。 ゲノム中の反復の推定割合は35.05％であり、大部分は線（38.4％）および正弦（5.56％）である（追加ファイル1：図。 S1&追加ファイル2:テーブルS1)。 ゲノムデータは、配列読み取りアーカイブ（＃SRP161190）に寄託された生の配列読み取りを有するNCBIで利用可能であり、ゲノムアセンブリは、アクセッション＃VEXN00000000の下でDDBJ/ENA/GenBank このホワイトペーパーで説明されているアセンブリバージョンはVEXN01000000です。
潜在的な自然免疫と抗菌ペプチド遺伝子の同定
爬虫類における自然免疫は、進化の成功の重要な側面ですが、これらの動物ではあまり理解されてい 先天性免疫は、抗体ではなく、Ｔ細胞ではない免疫の側面として定義される。 侵入する病原体に対する自然免疫応答には、サイトカインの発現；マクロファージ、白血球および他の白血球の活性化および動員；およびディフェンシンおよびカテリシジンのような抗菌ペプチドの発現が含まれ得る。
私たちは、この研究でコモドドラゴンゲノムの自然免疫遺伝子を同定するためのゲノミクスに基づくアプローチを取ってきました。 コモドゲノムを配列決定し，この巨大トカゲにおける自然免疫の発現に関与する可能性のある重要な自然免疫抗菌ペプチド遺伝子（β-デフェンシン，オボデフェンシンおよびカテリシジン）の遺伝子およびクラスターを調べた。
コモドゲノムにおけるβ-ディフェンシンおよび関連遺伝子
ディフェンシンはジスルフィド安定化抗菌ペプチドの一例であり、β-ディフェンシンは上皮表面での微生物コロニー形成に対する耐性に関与するジスルフィド安定化カチオン性抗菌ペプチドの脊椎動物ファミリーである。 Β-ディフェンシンペプチドは、保存されたシステイン残基の間隔（C-X6–C–X（3–5）–C–X（8–10）–C–X6-CC）と関連するジスルフィド結合パターン（Cys1-Cys5、Cys2-Cys4およびCys3-cys6）を有する特徴的なシステインモチーフによって定義されるが、システイン残基の数および間隔の変化が観察されている。 他のカチオン性抗菌ペプチドと同様に、β-ディフェンシンは、典型的には正味の正（カチオン性、塩基性）電荷を示す。
爬虫類におけるβ-ディフェンシンペプチド発現のin vivoでの役割に関する最初の広範な報告の一つは、傷ついたアノールトカゲ（Anolis carolinensis）におけるβ-ディフェンシンの誘導発現である。 爬虫類の好中球はカテリシジン様ペプチドとβ-デフェンシンペプチドの両方を含むか粒を有するようである。 β-デフェンシン様ペプチドは爬虫類の卵にも見られる。 トカゲのいくつかの種は、捕食者の脱出の方法として尾を失うことができ、これらの尾は、炎症や感染なしに創傷部位から再生することがよく知られて β-デフェンシンペプチドは創傷床における好塩基性か粒球内および関連上皮内の両方で発現され、分解細菌を含むファゴソームで観察される。 再生と関連付けられる傷に発火の明瞭な欠乏があり、特に2つのβ defensinsは治療のティッシュのハイレベルで全面的に表現されます、そこにanoleトカゲの傷の直
β-ディフェンシン遺伝子は、脊椎動物のゲノム内のクラスターに存在することが一般的に観察されている。 ヒトでは、33個のβ-ディフェンシン遺伝子が五つのクラスターで同定された。 最近，アヒル，シマウマフィンチ，ニワトリを含むいくつかの鳥種のゲノムの解析により，それぞれの種のゲノムにβ-ディフェンシンクラスターが含まれていることが明らかになった。 コモドドラゴンと密接に関連しているanoleトカゲ（Prickett,M.D.,未発表のwork in progress）では、β-defensin様遺伝子クラスターが最近同定されている。 興味深いことに、カテプシンB遺伝子（CTSB）は、ヒト、マウス、およびニワトリのβ-ディフェンシンクラスターの強力なマーカーとして同定されている。 そこで，カテプシンＢ遺伝子（ＣＴＳＢ）のコモドゲノムをβ-ディフェンシンクラスターの同定を支援する可能性のあるマーカーとして検討した。
これらの解析により、コモドドラゴンゲノムには合計66個のβ-defensin遺伝子が同定され、そのうち18個はコモドドラゴン特異的β-defensin遺伝子であると考えられている（表2）。 コモドドラゴンゲノムから同定されたβ-ディフェンシン遺伝子は，システイン間隔，遺伝子サイズ，β-ディフェンシンドメインを構成するシステイン残基の数，ならびにβ-ディフェンシンドメインの数に変化を示した。 保存されたシステイン残基の間隔に関しては、特に最後に（C–X6–C–X（3–5）–C–X（8–10）–C-X6-CC）、我々は五コモドドラゴンβ-ディフェンシン遺伝子が最後のシステインの間に存在し、16は最後のシステインの間に六つの残基を持っており、42は最後のシステインの間に五つの残基を持っているという点で、コモドドラゴンゲノムにおけるβ-ディフェンシン遺伝子の我々の分析にかなりの変動を発見した。遺伝子はより複雑なシステイン残基間隔パターンを示す（表2）。
鳥類や他の爬虫類と同様に、コモドドラゴンのdefensin遺伝子の大部分は、同じsyntenicブロック内の二つの別々のクラスターに存在するように見えます（Fig. 3). 一つのクラスターは、一方の端にXK、Kell血液型複合体サブユニット関連ファミリー、メンバー6（XKR6）の遺伝子によって隣接したβ-オボデフェンシンクラスターであり、もう一方の端にミオツブラリン関連タンパク質9（MTMR9）の遺伝子によって隣接したβ-オボデフェンシンクラスターである。 約400,000bpのクラスター間領域には、配列類似性167、メンバー A（FAM167A）、Blkプロト癌遺伝子、Srcファミリーチロシンキナーゼ（BLK）、ファルネシル-二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ1（FDFT1）、およびΒ-ディフェンシンクラスターの隣接遺伝子であるCTSB（カテプシンB）が含まれている。 3). 鳥、カメおよびワニでは、β defensinの集りのもう一方の端はTranslocation associated membrane protein2(TRAM2)のための遺伝子に先行しています。 調査した他のスクアメート（トカゲやヘビ）ゲノムのすべての場合と同様に、β-ディフェンシンクラスターの終わりの隣接遺伝子は、利用可能な無傷のクラスター
β-デフェンシン遺伝子ファミリークラスター。 同定されたコモドドラゴンdefensinとovodefensin遺伝子の足場の場所、コモドドラゴンゲノム内のdefensinとovodefensinクラスターを強調表示します
クラスターの端は、XPO1またはTRAM2のいずれかに隣接するか、またはどちらもできません。 ＴＲＡＭ２を有する足場４ ５上に見出される３つの遺伝子のうちの２つ（Ｖｋｂｄ８ ０Ａ、Ｖｋｂｄ８ ０Ｂ）は、ほぼ同一であり、潜在的には組立人工物の結果である。 この遺伝子は，鳥，カメ，ワニのβ-ディフェンシンクラスターにおける最終遺伝子のオルソログである。 この遺伝子のためのanole orthologは隔離され、TRAM2、XPO1、また他のどのβ-defensinsとも関連付けられません、そしてanole TRAM2の近さで見つけられるβ-defensinsがありません。 XPO1に関連する七つの遺伝子のうちの二つは、XPO1に関連する五つのアノール遺伝子の一つとオルソログを持っていますが、これらがβ-ディフェンシンクラスターの残りの部分または追加のクラスターの一部であるかどうかは、どちらの種でも決定することはできません。 ヘビのオルソログはTRAM2に関連付けられていますが、クラスターの一部ではありません。
構造の多様性
多様性は、β-ディフェンシンドメインの構造の変化に見ることができる。 典型的には、β-デフェンシンは2-3個のエクソンからなる：シグナルペプチド、プロピエースを持つエクソンと六つのシステインを持つβ-デフェンシンドメイン、場合によっては短い第三のエクソンからなる。 Β-デフェンシンドメインの数、エクソンサイズ、エクソン数、システインの非定型間隔、および/またはβ-デフェンシンドメインのシステインの数の変化は、調査されたすべての爬虫類種（未発表）で見出すことができる。 二つのディフェンシンドメイン（Vkbd7、Vkbd34、Vkbd43）を持つ三つのβ-ディフェンシンと三つのディフェンシンドメイン（Vkbd39）を持つ一つがある。 コモドドラゴンβ-デフェンシン遺伝子Vkbd12、Vkbd13、Vkbd14およびそれらのオルソログは、アノール中に非典型的に大きなエクソンを有する。 Vkbd16とVkbd21の間のβ-ディフェンシンのグループも非典型的に大きなエクソンを持っています。 システイン残基の間の非定型間隔は、三つのβ-ディフェンシン、Vkbd20（1-3-9-7）、Vkbd57（3-4-8-5）、およびVkbd79（3-10-16-6）で発見されている。 Β-デフェンシンドメインにはシステイン残基が付加されたβ-デフェンシンドメインが存在する。: Vkbd6 10システイン残基、および三つのβ-ディフェンシン、vkbd16、Vkbd17、およびvkbd18のグループ、八システイン残基を持つ。
Vkbd7の二つのβ-ディフェンシンドメインは、他の種のSquamataのオルソログを持つVkbd8の一つのβ-ディフェンシンドメインと相同である。 AnoleトカゲA.carolinensisには二つのオルソログ、一つのβ-defensinドメインを持つLzbd6と二つのβ-defensinドメインを持つ非クラスター Lzbd82がある。 ヘビ（Snbd5とSnbd6）のオルソログは、一つのβ-ディフェンシンドメインを持っています。 Vkbd34はアノール類ではLzbd39、ヘビ類ではSnbd15のオルソログである。 Vkbd39とVkbd43は、それぞれ三つと二つの相同β-デフェンシンドメインで構成され、Lzbd52、Lzbd53、およびLzbd55の第三のエクソンに相同であり、すべて二つの非相同β-デフェン 一つのβ-デフェンシンドメインを有するvkbd40は、Lzbd52、Lzbd53、Lzbd54（一つのデフェンシンドメインを有する）、およびLzbd55の第二のエクソンと相同である。
β-ディフェンシンドメイン中のシステイン数の増加により、追加のジスルフィド橋が形成される可能性がある。 この変異の例は、ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅ β−ｄｅｆｅｎｓｉｎ、Ｐｓｉｔｔａｃｉｆｏｒｍｅ Ａｖｂｄ１ ２に見出すことができる。 Vkbd6のβ-デフェンシンドメインは10個のシステインからなるようであり、そのうちの四つは典型的なβ-デフェンシンドメインの後に付加的な対のシステイン（C-X6-C-X4-C-X9-C-X6-CC-X7-C-X7-CC-X5-C）を持つ拡張の一部である。 コモドβ-ディフェンシンVkbd16、Vkbd17、およびVkbd18のグループは、非定型システイン間隔を有することに加えて、典型的な残基数内に八つのシステインを有する。 このグループ、Vkbd19に続くβ-defensinは、これら三つの遺伝子のパラログですが、β-defensinドメインは、より典型的な六つのシステイン残基を含んでいます。
これらのコモドβ-デフェンシン遺伝子の遺伝子構造は、支持する証拠と確認の対象となります。 アノールトカゲ類には、付加的な非β-デフェンシンドメインエクソンまたはより大きなエクソンを含む多くの非定型構造要素がある。
新たに同定されたKomodo dragon β-defensin遺伝子によってコードされるペプチド配列の分析により、このクラスの抗菌ペプチドに典型的なように、それらの大部分（53のうち66）が生理学的条件で正味の正電荷を有することが予測されていることが明らかになった（表3）。 しかしながら、四つのペプチド（Vkbd10、Vkbd28、Vkbd30およびVkbd34）は、pH7で弱くカチオン性または中性（+0.5–0）であると予測され、一方、九つのペプチド（Vkbd3、Vkbd4、Vkbd11、Vkbd19、Vkbd23、Vkbd26、Vkbd35、Vkbd36およびVkbd37）は弱く強アニオン性であると予測されることは注目に値する。 これらのペプチドはカノニカルβ-ディフェンシン構造的特徴を示し，β-ディフェンシン遺伝子クラスターに存在するが，β-ディフェンシンは典型的にカチオン性であり，その正電荷が抗菌活性に寄与するため，これらの遺伝子の一つ以上はβ-ディフェンシン様ペプチドまたはカノニカルβ-ディフェンシンにコードしないことが示唆された。
コモドドラゴンのオボデフェンシン遺伝子の同定
オボデフェンシン遺伝子は複数の鳥類および爬虫類の種で発見されており、卵白および他の組織で発現が見出されている。 鶏のペプチッドガリン（Gallusのgallus Ovoda1）を含むOvodefensinsはグラム陰性のE.coliおよびグラム陽性のS.aureusに対して抗菌活動があるために示されていました。 推定されるβ-オボデフェンシンは、鳥類および爬虫類のβ-デフェンシンクラスターと同じシンテンブロック内のクラスターに見出される。 A.carolinensis(8つのシステインβ-デフェンシンドメインを持つ1つ)とヘビ(8つのシステインβ-デフェンシンドメインを持つ4つ)で5つのβ-オボデフェンシンが発見されている(Prickett,M.D.,unpublished work in progress)。 コモドドラゴンクラスターは六つのβ-オボデフェンシンからなる（表4および5）。 Vkovod1は、カメやワニの最初のβ-オボデフェンシンに加えて、Snovod1の偽オルソログである。 デフェンシンドメインVkovod3、Vkovod4、およびVkovod6は、それぞれSnovod2、Snovod3、およびSnovod5のオーソログ、八システインで構成されています。 Vkovod4とVkovod6はLzovod14のオルソログである。
コモドドラゴンのカテリシジン遺伝子の同定
カテリシジンペプチド遺伝子は、ゲノミクスのアプローチを通じて爬虫類で最近同定されています。 複数のcathelicidinのペプチッド遺伝子は鳥、ヘビおよびanoleトカゲで識別されました。 機能的カテリシジン抗菌ペプチドの放出がニワトリのヘテロフィルから観察され，爬虫類のヘテロフィルもこれらのペプチドの供給源であることを示唆した。 アリバルディ他 カテリシジンペプチドは、ヘテロフィルに関連するものを含むアノールリザード組織で発現されていることが同定されている。 Cathelicidinの抗菌ペプチッドは他の動物の自然な免除の重要な役割を担い、そう多分コモドのドラゴンのこの役割をまた担うと考えられます。
アノールトカゲでは、4つの遺伝子からなるカテリシジン遺伝子クラスターは、<FASTK>カテリシジンクラスター<KLHL18>のように構成されている。 コモドドラゴンゲノムに類似したカテリシジンクラスターを検索した。 コモドドラゴンのゲノムからカテリシジン様遺伝子を検索すると、サフォールド84の一端に位置するカテリシジン遺伝子の最初の要件である”カテリン様ドメイン”を持つ三つの遺伝子のクラスターが明らかになった。 しかし、足場84のこの領域は、ギャップ、単離されたエクソン、および重複とアセンブリの問題を持っています。 この遺伝子は、アノールオルトロゴにちなんで命名された。 コモドドラゴンのカテリシジン（カテリシジン2とカテリシジン4.1）の二つは、アセンブリの問題のないセクションにあります。 対照的に、Cathlicidin4.2は、Cathelicidin4.1にparalogousである完全な遺伝子を作成するために、エクソン1-3と見当違いのエクソン4の多様なセットを使用して構築されました。 クラスターは足場の一方の端に発見されたように、このアセンブリで捕捉されていない追加の正体不明のカテリシジンがあるかもしれません。
カテリシジン抗菌ペプチド遺伝子配列の共通の特徴は、N末端のカテリンドメインが少なくとも4つのシステインをコードすることである。 ワニとヘビのカテリシジンの我々の研究では、我々はまた、典型的には、最後のシステインに続いて、VRRまたは同様の配列からなる三残基パターンがすぐに予測 カテリシジン抗菌ペプチド遺伝子配列の追加の要件は、C末端領域における正味陽性荷電ペプチドをコードし、典型的には第四エクソンによってコードされ、典型的には約35aaの長さ（25-37の範囲）であることである。 機能性抗菌ペプチドの切断および放出に関与する天然に存在するプロテアーゼは知られていないので、正確な切断部位の予測は困難である。 表６に示されるように、同定されたコモドドラゴンカテリシジン遺伝子候補のそれぞれについて予測されるアミノ酸配列が列挙されている。 各配列に我々の分析を実行して、我々は予測と各潜在的なカテリシジン遺伝子が抗菌ペプチドをコードすることができるかどうかについての結論を行
Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ２＿Ｖａｒｋｏ（ＶＫ−ＣＡＴＨ２）の予測されたＮ末端タンパク質配列が４つのシステインを含むことがわかる（下線、表６）。 但し、私達がワニおよび関連のcathelicidin順序で見たように最後のシステインの残余に続く~10のアミノ酸に明らかな”VRR”または同じような順序がありません。 さらに、35C末端アミノ酸の分析は、正味の正電荷を欠いている予測されたペプチド配列を明らかにする。 これらの理由から、本発明者らは、Cathelicidin2_Varko遺伝子配列がそのC末端で活性なcathelicidin抗菌ペプチドをコードしないことを予測する（表7）。
特定されたCathelicidin4.1_VARKO遺伝子について、予測されたcathelinドメインは、必要な四つのシステイン残基を含み（表6）、配列”VTR”は、アリゲーター cathelicidin遺伝子の”VRR”配列と同様に、最後のシステインの10アミノ酸内に存在する。 “VTR”配列に続く33-aa C末端ペプチドは、生理学的pHで正味+12電荷を有すると予測され、配列の大部分はヘリカルであると予測され、これはカテリシジンと一致している。 既知のカテリシジンの大部分は、重要な螺旋構造を有するセグメントを含む。 最後に，抗菌ペプチドデータベースを用いた配列の分析は，ペプチドが潜在的にカチオン性抗菌ペプチドであることを示した。 したがって、本発明者らは、この遺伝子がVK-CATH4.1と呼ばれる活性カテリシジン抗菌ペプチドをコードする可能性が高いと予測している（表7）。
さらに、このペプチドは、抗菌ペプチドデータベース内の他の既知の抗菌ペプチドといくつかの相同性を示す（表8）。 これは、スクアメートから同定されたカテリシジンペプチドとの特に高度の配列類似性を示し、実施例は表8に含まれる。 従って、予測されたVK-CATH4.1ペプチッドにcathelicidinのペプチッドの認刻極印の特徴の多数があり、それ以上の調査のための強い候補者です。 表8は、抗菌ペプチドデータベース内の既知のペプチドとのVK_CATH4.1のアラインメントを示す。
同定されたCathelicidin4.2_VARKO遺伝子については、予測されたcathelinドメインは、必要な四つのシステイン残基を含む（表6）。 Cathelicidin4.1_VARKO遺伝子で指摘されたように、配列”VTR”は第四システイン残基の10アミノ酸内に存在し、抗菌性であると予測される30-aaペプチドをコードするC末端セグ C末端ペプチドのアミノ酸配列は、生理学的pHで正味+10電荷を有すると予測され、抗菌ペプチドデータベース内の他の既知の抗菌ペプチドとの相同性 従って、VK-CATH4.1のように、この候補者のペプチッドはまたcathelicidinのペプチッドと関連付けられる認刻極印の特徴の多数を表わしそれ以上の調査のため 表8は、抗菌ペプチドデータベースからの既知のペプチドとのVK-CATH4.2の相同性およびアラインメントを示す。 最後に、機能性ペプチドVK-CATH4.2をコードする遺伝子配列は、活性カテリシジンペプチドの典型的な位置であるエクソン4上に見出される。 このエクソンはペプチド配列L D R V T R R R W R R F F Q KAKRFVKRHGVSIAVGAYRIIGをコードする。
予測されたペプチドVK-CATH4.2は、A.carolinensis、G.japonicus、およびP.bivittatusからの同様の予測されたC末端ペプチドを有する他の予測されたcathelicidin遺伝子からのペプチドと高度に相同である（表8）。 VK-CATH4の残基2-27。2は、予測されたC末端ペプチド（XP_008116755.1、aa130-155）と65％同一であり、80％類似している。 VK-CATH4.2の残基2〜30は、gecko Cathelicidin関連の予測されたC末端ペプチドと66％同一であり、82％類似している(XP_015277841.1,aa129-151)。 最後に、vk-CATH4.2のaa2-24は、Cathelicidin関連OH-CATH様の予測されたC末端ペプチド（XP_007445036.1、aa129-151）と57％同一であり、73％類似している。