tipos de Células no dragão-de-Komodo sangue
Uma amostra de sangue foi obtida a partir de um dragão-de-Komodo chamado Tujah no Santo Agostinho Alligator Farm Parque Zoológico, em conformidade com a necessária segurança e procedimentos regulamentares, e com as devidas aprovações. Na época da coleta, estávamos interessados em coletar tanto o DNA genômico para sequenciação como o mRNA para gerar uma biblioteca cDNA para facilitar nossos estudos proteômicos. Em aves, os heterófilos (glóbulos brancos) são conhecidos por expressar múltiplos peptídeos antimicrobianos . Os peptídeos antimicrobianos identificados a partir de heterófilos de galinha apresentam actividades imunomodulatórias antimicrobianas e dirigidas ao hospedeiro . Assim, depois de obter uma amostra inicial de sangue de dragão de Komodo fresco, permitimos que os glóbulos brancos se assentassem do sangue e os colhessem porque eles estavam provavelmente envolvidos com a expressão de peptídeo antimicrobiano. As células brancas do sangue do dragão-de-Komodo coletado foram então divididas uniformemente, com metade sendo processada para o isolamento do DNA genômico em preparação para a sequenciação e geração de bibliotecas, e a outra metade reservada para a extração do mRNA para os nossos estudos proteômicos.
em seguida, realizamos esfregaços e identificamos os vários tipos de células que observamos. A identificação de células imunitárias no sangue de dragão de Komodo é um desafio devido à literatura publicada limitada para referência. Os vários tipos de células que foram observados nos esfregaços de sangue manchados de Wright são mostrados na Fig. 2. Identificámos estas células com base na semelhança com as células imunitárias que tínhamos identificado anteriormente no sangue de jacaré americano . De interesse foram os grandes e alongados núcleos de glóbulos vermelhos deste réptil. Além disso, conseguimos identificar heterófilos (semelhantes aos granulócitos), uma provável fonte de peptídeos catelicidina, bem como células de monócitos e linfócitos.
os glóbulos vermelhos do Dragão-de-Komodo e as células imunitárias. Células do sangue do dragão-de-Komodo foram visualizados por Wright mancha e imagens em 40x. Tipos de células são identificadas como: A. nucleadas de células vermelhas do sangue, B. monócitos, C. de linfócitos, e D. heterophil
Um segundo exemplo de dragão-de-Komodo sangue foi mais tarde recolhidos e processados para extração do DNA genômico por cauda de andorinha Genômica para obter o sequenciamento. Os investigadores da Dovetail Genomics não separaram os glóbulos brancos e, em vez disso, extraíram ADN de células peletadas directamente do sangue total.
Assembly and annotation of the Komodo dragon genome
Previous analyses of Komodo dragon erythrocytes using flow cytometry estimated the genome to be approximately 1,93 Gb in size . Usando sequências de iluminação profunda e abordagens de dobradiça, obtivemos um rascunho de conjunto do genoma que tinha 1,60 Gb de tamanho, semelhante ao tamanho do genoma do lagarto A. carolinensis que é 1,78 Gb . O rascunho contém 67.605 andaimes com N50 de 23,2 Mb (Quadro 1). Um total de 17.213 genes foram previstos, e 16.757 (97.35%) deles foram anotados. As estimativas de integralidade com a CEGMA foram de 56% (“completo”) e 94% (“parcial”). A percentagem estimada de repetições no genoma é de 35,05%, sendo a maioria linhas (38,4%) e SINEs (5,56%) (ficheiro adicional 1: Fig. S1 & ficheiro adicional 2: Quadro S1). Os dados genômicos estarão disponíveis na NCBI com sequências raw lidas depositadas no Sequence Read Archive (#SRP161190), e no genome assembly at DDBJ/ENA/GenBank under the accession #VEXN00000000. A versão de montagem descrita neste artigo é VEXN01000000.
a identificação de potencial imunidade inata e de genes peptídicos antimicrobianos
imunidade inata em répteis é um aspecto crítico do seu sucesso evolucionário, mas permanece pouco compreendido nestes animais. A imunidade inata é definida como os aspectos da imunidade que não são anticorpos e não são células-T. As respostas imunitárias inatas a patógenos invasores podem incluir a expressão de citoquinas; a ativação e Recrutamento de macrófagos, leucócitos e outros glóbulos brancos; e a expressão de peptídeos antimicrobianos, tais como defesas e catelicidinas .
tomámos uma abordagem baseada em genómica para identificar genes de imunidade inata no genoma do dragão de Komodo neste trabalho. Nós sequenciamos o genoma Komodo e examinamos para genes e aglomerados de importante imunidade inata genes peptídicos antimicrobianos (β-defensinas, ovodefensinas e catelicidinas), que estão provavelmente envolvidos em expressões de imunidade inata neste lagarto gigante.
β-Defensina e genes relacionados no genoma do Komodo
as defensinas são um exemplo de peptídeos antimicrobianos estabilizados por dissulfureto, sendo as β-defensinas uma família de peptídeos antimicrobianos catiónicos, estabilizados por dissulfureto, envolvidos na resistência à colonização microbiana em superfícies epiteliais . O β-defensin peptídeos são definidos por uma característica de seis cisteína motivo com conservados de cisteína resíduo espaçamento (C–X6–C–X (3-5)–C–X (8-10)–C–X6–CC) e associado bissulfeto de ligação padrão (Cys1-Cys5, Cys2-Cys4 e Cys3-Cys6); no entanto, variações no número e espaçamento entre resíduos de cisteína tem sido observado. Tal como acontece com outros péptidos antimicrobianos catiónicos, as β-defensinas apresentam tipicamente uma carga positiva líquida (catiónica, básica).
um dos primeiros relatórios extensos de um papel in vivo para a expressão peptídica Da β-defensina nos répteis é a expressão indutível de β-defensinas em lagartos Anol feridos (Anolis carolinensis) . Os neutrófilos répteis parecem ter grânulos que contêm péptidos semelhantes à catelicidina, bem como péptidos de β-defensina. os peptídeos semelhantes a β-defensina também são encontrados em ovos de répteis . É bem conhecido que algumas espécies de lagarto podem perder suas caudas como um método de fuga do predador, e que essas caudas então regeneram-se do local da ferida sem inflamação ou infecção. os peptídeos de β-defensina são expressos tanto no interior dos granulócitos azurofílicos no leito da ferida como no epitélio associado e são observados em fagossomas contendo bactérias degradadas. Há uma distinta falta de inflamação na ferida, que está associado com a regeneração, e duas β-defensinas, em particular, são expressas em níveis elevados na cicatrização de tecidos no Geral, parece haver um papel significativo para as β-defensinas na cicatrização de feridas e regeneração anole lagarto .
os genes Da β-defensina têm sido geralmente observados para residir em aglomerados dentro dos genomas dos vertebrados . Em humanos, 33 genes Da β-defensina foram identificados em cinco aglomerados. Recentemente, análises dos genomas de várias espécies aviárias, incluindo pato, pássaro-zebra e frango, revelaram que o genoma de cada espécie continha um aglomerado de β-defensina . Um aglomerado genético semelhante a β-defensina foi recentemente identificado no lagarto Anol (Prickett, M. D., trabalhos não publicados em progresso), que está intimamente relacionado com o dragão-de-Komodo . Curiosamente, o gene da catepsina B (CTSB) foi identificado como um marcador forte para aglomerados de β-defensina em humanos, ratos e galinhas . Assim, examinamos o genoma de Komodo para o gene da catepsina B (CTSB) como um marcador potencial para ajudar na identificação do(s) cluster (s) de β-defensina nele.
através destas análises, identificámos um total de 66 potenciais genes de β-defensina no genoma do dragão de Komodo, dos quais 18 são considerados genes de β-defensina específicos do dragão de Komodo (Quadro 2). Os genes Da β-defensina identificados a partir do genoma do dragão de Komodo exibem variações no espaçamento de cisteína, Tamanho do gene, o número de resíduos de cisteína que compõem o domínio da β-defensina, bem como o número de domínios Da β-defensina. Com relação à conservados de cisteína resíduo espaçamento, especialmente no final (C–X6–C–X (3-5)–C–X (8-10)–C–X6–CC), encontramos uma variabilidade considerável na nossa análise dos β-defensin genes em o dragão-de-Komodo genoma, em que cinco dragão-de-Komodo β-defensin genes têm sete reside entre o último cysteines, de 16 de seis resíduos entre o último cysteines, 42 têm cinco resíduos entre o último cysteines, e três dragão-de-Komodo β-defensin genes apresentam mais complexas cisteína-resíduo espaçamento de padrões (Tabela 2).
Como com aves e outros répteis, a maioria de dragão-de-Komodo defensin genes parecem residir em dois clusters distintos dentro de um mesmo syntenic bloco (Fig. 3). Um aglomerado é um aglomerado de β-ovodefensina flanqueado em uma extremidade pelo gene para XK, família de complexo de grupos sanguíneos de Kell, membro 6 (XKR6) e na outra extremidade pelo gene para a proteína 9 relacionada com a Miotubularina (MTMR9). O intercluster região de cerca de 400.000 bp inclui os genes para a Família com a sequência de similaridade 167, membro de UMA (FAM167A); BLK proto-oncogene, Src família tirosina quinase (BLK); inibidores de farnesil-difosfato inibidores de farnesil transferase 1 (FDFT1); e CTSB (catepsina B), que é um flanqueando o gene de β-defensin cluster (Fig. 3). Em aves, tartarugas e crocodilianos, a outra extremidade do aglomerado de β-defensina é seguida pelo gene para translocação associada proteína de membrana 2 (TRAM2). Como é o caso de todos os outros genomas de squamate (lagartos e cobras) pesquisados, o gene flanqueador para o fim do aglomerado de β-defensina não pode ser definitivamente determinado atualmente, uma vez que não existem genomas de squamate com aglomerados intactos disponíveis.
clusters da família genética da β-defensina. Andaime locais identificados dragão-de-Komodo defensin e ovodefensin genes, destacando-se o defensin e ovodefensin clusters em o dragão-de-Komodo genoma
O fim do cluster pode ser ladeado por XPO1 ou TRAM2 ou não. Dois dos três genes encontrados no andaime 45 com TRAM2 (VkBD80a, VkBD80b) são quase idênticos e potencialmente o resultado de um artefato de montagem. Os genes são ortólogos para o gene final nos aglomerados aviário, tartaruga e crocodiliano de β-defensina. O anole ortholog para este gene é isolado e não está associado com TRAM2, XPO1, nem qualquer outra β-defensinas, e não há nenhum β-defensinas encontrado nas proximidades de anole TRAM2. Dois dos sete genes associados ao XPO1 têm ortólogos com um dos cinco genes anóis associados ao XPO1, mas não pode ser determinado em qualquer das espécies se estes forem parte do resto do aglomerado de β-defensina ou parte de um aglomerado adicional. Os ortólogos da Cobra estão associados com TRAM2, mas não fazem parte do aglomerado.
diversidade estrutural
diversidade pode ser vista em variações na estrutura do domínio da β-defensina. Tipicamente, uma β-defensina consiste de 2-3 exons: um peptídeo sinal, um exon com a hélice e domínio β-defensina com seis cisteínas, e em alguns casos, um pequeno terceiro exon. Variações no número de domínios β-defensin, tamanho exon, número exon, espaçamento atípico de cisteínas, e/ou o número de cisteínas no domínio β-defensin podem ser encontrados em todas as espécies reptilianas pesquisadas (não publicadas). Existem três defesas β Com dois domínios defensin (vkbd7, VkBD34, e VkBD43) e um com três domínios defensin (VkBD39). Os genes do dragão de Komodo β-defensina VkBD12, VkBD13, e VkBD14 e seus ortólogos em anóis têm exons atipicamente grandes. O grupo de β-defensinas entre VkBD16 e VkBD21 também tem exões atipicamente grandes. O espaçamento atípico entre os resíduos de cisteína é encontrado em três β-defensinas, VkBD20 (1-3-9-7), VkBD57 (3-4-8-5) e VkBD79 (3-10-16-6). Existem quatro defesas β Com resíduos de cisteína adicionais no domínio da β-defensina: VkBD6 com 10 resíduos de cisteína, e um grupo de três β-defensinas, VkBD16, VkBD17, e VkBD18, com oito resíduos de cisteína.
os dois domínios β-defensin do VkBD7 são homólogos ao Domínio β-defensin do vkbd8 com ortólogos em outras espécies de Squamata. No lagarto Anol A. carolinensis há dois ortólogos, LzBD6 com um domínio de β-defensina e o não cluster LzBD82 com dois domínios β-defensin. Os ortólogos em cobras (SnBD5 e SnBD6) têm um domínio de β-defensina. VkBD34 é um ortolog de LzBD39 em anóis e SnBD15 em cobras. VkBD39 e VkBD43 consistem de três e dois homólogos β-defensin domínios respectivamente, que são homólogos ao terceiro exões de LzBD52, LzBD53, e LzBD55, todos os que têm duas não-homólogos β-defensin domínios. VkBD40 com um domínio de β-defensin é homólogo aos exons de LzBD52, LzBD53, LzBD54 (com um domínio de defensin), e LzBD55.
um aumento no número de cisteínas no domínio da β-defensina resulta na Possível formação de pontes dissulfureto adicionais. Exemplos desta variação podem ser encontrados na psittacine β-defensina, Psittaciforme AvBD12 . O β-defensin domínio de VkBD6 parece consistir de 10 cysteines, quatro dos quais são parte de uma prorrogação, após um típico β-defensin de domínio com um adicional emparelhado cisteína (C-X6-C-X4-C-X9-C-X6-CC-X7-C-X7-CC-X5-C). O grupo de Komodo β-defensinas VkBD16, VkBD17 e VkBD18, além de ter um espaçamento atípico de cisteína, também tem oito cisteínas dentro de um número típico de resíduos. A β-defensina que segue Este grupo, VkBD19, é um paralog destes três genes; no entanto, o domínio da β-defensina contém os seis resíduos de cisteína mais típicos.
as estruturas genéticas destes genes Da β-defensina de Komodo estão sujeitas a confirmação com provas de apoio. Há uma série de elementos de estrutura atípica em lagartos anóis, incluindo exons de domínio não β-defensina ou exons maiores.
análises das sequências peptídicas codificadas pelos recém-identificados genes Da β-defensina do dragão de Komodo revelaram que a maioria (53 em 66) deles é prevista para ter uma carga positiva líquida em condições fisiológicas, como é típico para esta classe de peptídeo antimicrobiano (Tabela 3). No entanto, é notável que quatro peptídeos (VkBD10, VkBD28, VkBD30 e VkBD34) está previsto para ser fracamente catiônicos ou neutro (+ de 0,5–0) em pH 7, enquanto nove peptídeos (VkBD3, VkBD4, VkBD11, VkBD19, VkBD23, VkBD26, VkBD35, VkBD36 e VkBD37) está previsto para ser fracamente fortemente aniônico. Esses achados sugerem enquanto estes peptídeos apresentam canônico β-defensin características estruturais e residem em β-defensin gene clusters, um ou mais desses genes podem não codifica para a β-defensin-como peptídeos ou canônico β-defensinas, porque as β-defensinas, normalmente, são catiônicos e sua carga positiva contribui para a sua atividade antimicrobiana.
Identificação de dragão-de-Komodo ovodefensin genes
Ovodefensin genes têm sido encontradas em vários aves e espécies de répteis , com expressão encontrada na clara de ovo e outros tecidos. Foi demonstrado que as ovodefensinas, incluindo o péptido-de-galinha Galin (Gallus gallus OvoDA1), têm actividade antimicrobiana contra a E. coli Gram-negativa e o S. aureus Gram-positivo. As presumíveis β-ovodefensinas são encontradas num aglomerado no mesmo bloco sinténico que o aglomerado de β-defensina em aves e répteis. Foram encontradas 19 β-ovodefensinas em A. carolinensis (uma com oito domínios de cisteína β-defensina) e cinco em cobras (quatro com oito domínios de cisteína β-defensina) (Prickett, M. D., trabalhos não publicados em curso). O aglomerado de dragões-de-Komodo consiste em seis β-ovodefensinas (tabelas 4 e 5). Dois destes podem ser o dragão-de-Komodo específico; VkOVOD1, que é um pseudois um ortolog de SnOVOD1, além do primeiro β-ovodefensina em tartarugas e crocodilianos. O defensin domínios VkOVOD3, VkOVOD4, e VkOVOD6 consistem em oito cysteines, ortólogos’de SnOVOD2, SnOVOD3, e SnOVOD5, respectivamente. VkOVOD4 e VkOVOD6 são ortólogos’de LzOVOD14.
a Identificação do dragão-de-Komodo cathelicidin genes
Cathelcidin peptídeo genes foram recentemente identificados em répteis através de genômica abordagens . Vários genes peptídicos catelicidina foram identificados em aves , cobras e lagarto Anol . A libertação de peptídeos antimicrobianos catelicidina funcionais tem sido observada a partir de heterófilos de Galinhas, sugerindo que os heterófilos reptilianos também podem ser uma fonte destes peptídeos . Alibardi et al. identificaram peptídeos catelicidina expressos em tecidos de lagartos anóis, incluindo associados a heterófilos . Pensa-se que os peptídeos antimicrobianos catelicidina desempenham papéis-chave na imunidade inata em outros animais e, portanto, também desempenham este papel no Dragão de Komodo.
Em anole lagartos, o cathelicidin gene cluster, consistindo de 4 genes, é organizado da seguinte forma: <FASTK> cathelicidin cluster <KLHL18>. Procuramos um aglomerado semelhante de catelicidina no genoma do Dragão de Komodo. Pesquisar o genoma do dragão de Komodo para genes semelhantes à catelicidina revelou um conjunto de três genes que têm um “domínio semelhante à catelina”, que é a primeira exigência de um gene de catelicidina, localizado em uma extremidade do saffold 84. No entanto, esta região do andaime 84 tem problemas de montagem com lacunas, exões isolados e duplicações. Os genes da catelicidina-dragão-de-Komodo identificados foram nomeados em homenagem aos seus ortólogos anolares. Duas das catelicidinas do dragão de Komodo (Catelicidin2 e Catelicidin4. 1) estão em seções sem problemas de montagem. Em contraste, a Catlicidin4. 2 foi construída usando um conjunto diversificado de exons 1-3 e um exon 4 deslocado para criar um gene completo, que é paralógico para a Catelicidin4. 1. Como o aglomerado é encontrado em uma extremidade do andaime, pode haver catelicidinas não identificadas adicionais que não são capturados neste conjunto.
uma característica comum das sequências de péptidos antimicrobianos da catelicidina é que o domínio da catelina N-terminal codifica pelo menos 4 cisteínas. Em nosso estudo de aligátores e catelicidinas de cobra também notamos que tipicamente seguindo a última cisteína ,um padrão de três resíduos consistindo de VRR ou sequência similar imediatamente precede o peptídeo C-terminal catiônico antimicrobiano. Requisitos adicionais de um péptido antimicrobiano catelicidina são que ele codifica para um péptido líquido positivo carregado na região Terminal C, é tipicamente codificado pelo quarto exon, e é tipicamente de aproximadamente 35 aa de comprimento (intervalo 25-37) . Uma vez que a protease de ocorrência natural responsável pela clivagem e libertação dos peptídeos antimicrobianos funcionais não é conhecida, a previsão do local exacto de clivagem é difícil. Como pode ser visto na Tabela 6, as sequências de aminoácidos previstas para cada um dos candidatos identificados ao gene de Dragão de Komodo catelicidina são listadas. Realizando nossa análise em cada sequência, fizemos previsões e conclusões sobre se cada potencial gene catelicidina pode codificar para um peptídeo antimicrobiano.
pode-se ver que a sequência N-terminal de proteínas prevista da Catelicidin2_varko (VK-CATH2) contém quatro cisteínas (sublinhadas, Tabela 6). No entanto, não há uma sequência óbvia ” VRR ” ou similar nos ~ 10 aminoácidos após o último resíduo de cisteína como vimos nas sequências aligátor e catelicidina relacionadas . Além disso, a análise dos 35 aminoácidos c-terminais revela uma sequência peptídica prevista sem carga líquida positiva. Por estas razões, prevemos que a sequência genética Catelicidin2_varko não se codifica para um peptídeo antimicrobiano activo no seu C-terminal (Tabela 7).
Para identificados Cathelicidin4.1_VARKO gene, o previsto cathelin-domínio inclui o requisito de quatro resíduos de cisteína (Tabela 6), e a sequência de “VTR” está presente, no prazo de 10 aminoácidos da última cisteína, semelhante ao “VRR” sequência no jacaré cathelicidin gene . Prevê-se que o peptídeo C-terminal 33-aa após a sequência “VTR” tenha uma carga líquida + 12 a pH fisiológico, e uma grande parte da sequência seja helicoidal , o que é consistente com as catelicidinas. A maioria das catelicidinas conhecidas contém segmentos com estrutura helicoidal significativa . Por último, a análise da sequência utilizando a base de dados de peptídeos antimicrobianos indica que o peptídeo é potencialmente um peptídeo antimicrobiano catiónico . Assim, prevemos que este gene provavelmente codifica para um peptídeo antimicrobiano ativo, chamado VK-CATH4. 1 (Tabela 7).
além disso, este péptido demonstra alguma homologia a outros péptidos antimicrobianos conhecidos na Base de dados de Peptidos antimicrobianos (Tabela 8). Apresenta um grau particularmente elevado de similaridade de sequência com peptídeos catelicidina identificados a partir de squamates, com exemplos incluídos na Tabela 8. Assim, o peptídeo VK-CATH4.1 previsto tem muitas das características marcantes de um peptídeo catelicidina e é um forte candidato para estudo posterior. O quadro 8 mostra o alinhamento do VK_ CATH4.1 com peptídeos conhecidos na Base de dados de peptídeos antimicrobianos .
para o gene Catelicidin4.2_VARKO identificado, o domínio da catelina previsto inclui os quatro resíduos de cisteína necessários (Quadro 6). Como foi observado no gene Catelicidin4.1_VARKO, a sequência “VTR” está presente dentro de 10 aminoácidos do quarto resíduo de cisteína, e imediatamente precede o segmento C-terminal, que codifica para um peptídeo de 30-aa que se prevê ser antimicrobiano . Prevê-se que a sequência de aminoácidos do peptídeo C-terminal tenha uma carga líquida + 10 no pH fisiológico, e demonstra graus variados de homologia a outros peptídeos antimicrobianos conhecidos na Base de dados de peptídeos antimicrobianos . Assim, como o VK-CATH4. 1, este peptídeo candidato também exibe muitas das características hallmark associadas com peptídeos catelicidina, e é um segundo forte candidato para mais estudos. A tabela 8 mostra a homologia e o alinhamento do VK-CATH4.2 com peptídeos conhecidos da Base de dados de peptídeos antimicrobianos. Finalmente, a sequência genética que codifica o peptídeo funcional VK-CATH4.2 é encontrada no exon 4, que é a localização típica do peptídeo catelicidina activo. Este exon codifica a sequência peptídica LDRVTRRRRRFFQKAKRFVKRHGVSIAVGAYRIIG.
o peptídeo VK-CATH4.2 previsto é altamente homólogo com peptídeos de outros genes catelicidina previstos, com peptídeos C-terminal semelhantes, de A. carolinensis, G. japonicus e P. bivittatus (Quadro 8). Resíduos 2-27 de VK-CATH4.2 são 65% idênticos e 80% semelhantes aos peptídeos c-terminais Anol-2 previstos (XP_008116755.1, aa 130-155). Os resíduos 2-30 do VK-CATH4, 2 são 66% idênticos e 82% semelhantes ao peptídeo C-terminal previsto relacionado com a gecko (XP_015277841.1, aa 129-151). Por último, o aa 2-24 de VK-CATH4.2 é 57% idêntico e 73% semelhante ao peptídeo terminal C previsto semelhante à Catelicidina (XP_007445036.1, aa 129-151).