celltyper i Komodo dragon blood
ett blodprov erhölls från en Komodo dragon som heter Tujah vid Saint Augustine Alligator Farm Zoological Park i enlighet med nödvändiga säkerhets-och regleringsförfaranden och med lämpliga godkännanden. Vid insamlingstidpunkten var vi intresserade av att samla in både genomiskt DNA för sekvensering såväl som mRNA för att generera ett cDNA-bibliotek för att underlätta våra proteomiska studier. Hos fåglar är heterofilerna (vita blodkroppar) kända för att uttrycka flera antimikrobiella peptider . Antimikrobiella peptider identifierade från kyckling heterofiler uppvisar betydande antimikrobiella och värdstyrda immunmodulerande aktiviteter . Följaktligen, efter att ha erhållit ett första prov av färskt Komodo-drakblod, tillät vi de vita blodkropparna att sätta sig ur blodet och samlade dem eftersom de sannolikt skulle vara involverade i antimikrobiellt peptiduttryck. De samlade Komodo dragon vita blodkropparna delades sedan jämnt, med hälften bearbetad för isolering av genomiskt DNA som förberedelse för sekvensering och biblioteksgenerering, och den andra hälften reserverad för mRNA-extraktion för våra proteomiska studier.
vi utförde sedan utstryk och identifierade de olika celltyper som vi observerade. Immuncellidentifiering i Komodo dragon blood är utmanande på grund av begränsad publicerad litteratur som referens. De olika celltyperna som observerades i Wright-färgade blodutstryk visas i Fig. 2. Vi identifierade dessa celler baserat på likhet med de immunceller som vi tidigare hade identifierat i det amerikanska alligatorblodet . Av intresse var de stora och långsträckta kärnbildade röda blodkropparna i denna reptil. Dessutom kunde vi identifiera heterofiler (liknande granulocyter), en sannolik källa till katelicidinpeptider, såväl som monocyt-och lymfocytceller.
Komodo dragon röda blodkroppar och immunceller. Blodceller från Komodo dragon visualiserades av Wright-fläck och avbildades vid 40x. celltyper identifieras som: A. kärnbildad röd blodcell, B. monocyt, C. Lymfocyt och D. heterofil
ett andra prov av Komodo-drakblod samlades senare in och bearbetades för genomisk DNA-extraktion genom Svanssvansgenomik för ytterligare sekvensering. Forskarna vid Dovetail genomics separerade inte vita blodkroppar och extraherade istället DNA från celler som pelleterades direkt från helblod.
montering och annotering av Komodo dragon genome
tidigare analyser av Komodo dragon erytrocyter med flödescytometri uppskattade genomet att vara ungefär 1,93 Gb i storlek . Med hjälp av djupa Illumina-sekvenser och Svanssvansar fick vi ett utkast till genommontering som var 1,60 Gb stort, liknande genomstorleken på A. carolinensis ödla genom som är 1,78 Gb . Utkastet innehåller 67 605 byggnadsställningar med N50 på 23,2 Mb (Tabell 1). Totalt förutsågs 17 213 gener och 16 757 (97,35%) av dem antecknades. Uppskattningarna av fullständigheten med CEGMA var 56% (’fullständig’) och 94% (’partiell’). Den uppskattade andelen upprepningar i genomet är 35,05% med majoriteten linjer (38,4%) och SINEs (5,56%) (ytterligare fil 1: Fig. S1 & ytterligare Fil 2: Tabell S1). Genomiska data kommer att finnas tillgängliga på NCBI med raw-sekvenseringsläsningar deponerade i Sekvensläsningsarkivet (#SRP161190) och genomenheten vid DDBJ/ENA/GenBank under anslutningen #VEXN00000000. Monteringsversionen som beskrivs i detta dokument är VEXN01000000.
identifiering av potentiell medfödd immunitet och antimikrobiella peptidgener
medfödd immunitet hos reptiler är en kritisk aspekt av deras evolutionära framgång, men det är fortfarande dåligt förstått hos dessa djur. Medfödd immunitet definieras som de aspekter av immunitet som inte är antikroppar och inte T-celler. Medfödda immunsvar mot invaderande patogener kan inkludera uttryck av cytokiner; aktivering och rekrytering av makrofager, leukocyter och andra vita blodkroppar; och uttrycket av antimikrobiella peptider såsom defensiner och katelicidiner .
vi har tagit ett genomicsbaserat tillvägagångssätt för att identifiera medfödda immunitetsgener i Komodo dragon-genomet i detta arbete. Vi har sekvenserat Komodo-genomet och undersökt det för gener och kluster av viktiga medfödda immunitetsantimicrobial peptide gener (AUC-defensins, ovodefensins och cathelicidins), som sannolikt är involverade i uttryck av medfödd immunitet i denna jätte ödla.
Bisexuell-Defensin och besläktade gener i Komodo-genomet
defensiner är ett exempel på disulfidstabiliserade antimikrobiella peptider, med en unik ryggradsfamilj av disulfidstabiliserade, katjoniska antimikrobiella peptider involverade i resistens mot mikrobiell kolonisering vid epitelytor . De CBD-defensin peptider definieras av en karakteristisk sex-cystein motiv med konserverad cystein restavstånd (C–X6–C–X (3-5)–C–X (8-10)–C–X6–CC) och tillhörande disulfidbindningsmönster (Cys1-Cys5, Cys2-Cys4 och Cys3-Cys6); emellertid har variationer i antalet och avståndet mellan cystein rester observerats. Som med andra katjoniska antimikrobiella peptider uppvisar vanligtvis en nettopositiv (katjonisk, grundläggande) laddning.
en av de första omfattande rapporterna om en in vivo-roll för Expression av peptid i reptiler för användning vid användning av t .ex. Reptilneutrofiler verkar ha granuler som innehåller både katelicidinliknande peptider såväl som peptider med stöd av sackaros. i reptilägg finns också en defensin-liknande peptid . Det är välkänt att vissa arter av ödla kan förlora sina svansar som en metod för rovdjursflykt, och att dessa svansar sedan regenererar från sårstället utan inflammation eller infektion. -defensin peptider uttrycks både inom de azurofila granulocyterna i sårbädden såväl som i det associerade epitelet och observeras i fagosomer innehållande nedbrutna bakterier. Det finns en tydlig brist på inflammation i såret, vilket är förknippat med regenerering, och i synnerhet två CBD-defensiner uttrycks vid höga nivåer i läkningsvävnaderna totalt sett verkar det finnas en viktig roll för ozi-defensinerna i sårläkning och regenerering i anolödlan .
generellt sett har man observerat att de bor i kluster inom genomerna hos ryggradsdjur . Hos människor identifierades så många som 33 dB-defensin-gener i fem kluster . Nyligen, analyser av genomerna av flera fågelarter inklusive anka, zebrafink och kyckling avslöjade att genomet för varje art innehöll ett kluster av försvar mot bakterier . Ett gigantiskt genkluster som liknar den i anole lizard (Prickett, M. D., opublicerat pågående arbete), som är nära besläktat med Komodo dragon, har nyligen identifierats i anole lizard (Prickett, M. D., opublicerat work in progress). Intressant är att cathepsin B-genen (CTSB) har identifierats som en stark markör för kluster av hCG i människor, möss och kycklingar . Således undersökte vi Komodo-genomet för cathepsin B-genen (CTSB) som en potentiell markör för att hjälpa till vid identifieringen av de(a) kluster (er) i den.
genom dessa analyser har vi identifierat totalt 66 potentiella gener av typen Baccarat-defensin i Komodo-drakgenomet, varav 18 anses vara Komodo-drakspecifika gener av typen Baccarat-defensin (Tabell 2). De gener som identifierats från Komodo dragon-genomet uppvisar variationer i cysteinavstånd, genstorlek, antalet cysteinrester som omfattar domänen för defensin, liksom antalet domäner för defensin. Med avseende på det konserverade cysteinrestavståndet, särskilt i slutet (C–X6–C–X (3-5)–C–X (8-10)–C–X6–CC), fann vi stor variation i vår analys av generna av Baccarat-defensin i Komodo-drakgenomet, genom att fem Komodo-drake Baccarat-defensin-gener har sju bosatt mellan de sista cysteinerna, 16 har sex rester mellan de sista cysteinerna, 42 har fem rester mellan de sista cysteinerna och tre Komodo-drake Baccarat-defensin gener uppvisar mer komplexa cystein-restavståndsmönster (tabell 2).
som med fåglar och andra reptiler verkar majoriteten av Komodo dragon defensin-gener ligga i två separata kluster inom samma synteniska block (Fig. 3). Ett kluster är ett kluster av äggdefensin som flankeras i ena änden av genen för XK, kell-blodgruppskomplex subenhetsrelaterad familj, medlem 6 (XKR6) och i andra änden av genen för Myotubularinrelaterat protein 9 (MTMR9). Interklusterregionen på cirka 400 000 bp inkluderar generna för Familj med sekvenslikhet 167, medlem a (FAM167A); BLK proto-onkogen, src-familjtyrosinkinas (BLK); Farnesyl-difosfat farnesyltransferas 1 (FDFT1); och CTSB (cathepsin B), som är en flankerande gen för tuberculosis-defensin-klustret (Fig. 3). Hos fåglar, sköldpaddor och krokodilianer följs den andra änden av kluster av BAC-defensin av genen för Translokationsassocierat membranprotein 2 (TRAM2). Såsom är fallet med alla andra undersökta squamate-(ödlor och ormar) – genomer, kan den flankerande genen för slutet av kluster av Baccarat-defensin inte definitivt bestämmas för närvarande eftersom det inte finns några squamate-genom med intakta kluster tillgängliga.
-defensin genfamilj kluster. Ställningsplatser för de identifierade Komodo dragon defensin-och ovodefensin-generna, som belyser defensin-och ovodefensin-kluster i Komodo dragon-genomet
klustrets ände kan antingen flankeras av XPO1 eller TRAM2 eller varken. Två av de tre generna som finns på scaffold 45 med TRAM2 (VkBD80a, VkBD80b) är nästan identiska och potentiellt resultatet av en monteringsartefakt. Generna är orthologs för den slutliga genen i fågel -, sköldpadda-och krokodilianabi-defensin-kluster. Anole-orthologen för denna gen är isolerad och är inte associerad med TRAM2, XPO1 eller några andra Bisexuell-defensiner, och det finns inga Bisexuell-defensiner som finns i närheten av anole TRAM2. Två av de sju generna associerade med XPO1 har orthologer med en av de fem anolgenerna associerade med XPO1 men det kan inte bestämmas i någon av arterna om dessa är en del av resten av tuberkelbacillerna eller en del av ett ytterligare kluster. Ormortologerna är associerade med TRAM2 men ingår inte i klustret.
strukturell mångfald
mångfald kan ses i variationer i strukturen för domänen för defensin. Vanligtvis består ett Macau-defensin av 2-3 exoner: en signalpeptid, en exon med propiece-och Macau-defensin-domänen med sex cysteiner, och i vissa fall en kort tredje exon. Variationer i antalet domäner för försvar mot mikrober, exonstorlek, exontal, atypiskt avstånd mellan cysteiner och/eller antalet cysteiner i domänen för försvar mot bakterier finns i alla undersökta reptilarter (opublicerade). Det finns tre defensins med två försvarsdomäner (VkBD7, VkBD34 och VkBD43) och en med tre försvarsdomäner (VkBD39). De Komodo dragon Bisexuell-defensin gener VkBD12, VkBD13 och VkBD14 och deras ortologer i anoler har atypiskt stora exoner. Gruppen av defensins mellan vkbd16 och VkBD21 har också atypiskt stora exoner. Atypiskt avstånd mellan cysteinrester finns i tre GHz-defensiner, VkBD20 (1-3-9-7), VkBD57 (3-4-8-5) och VkBD79 (3-10-16-6). Det finns fyra Baku-defensiner med ytterligare cysteinrester i domänen för Baku-defensin: VkBD6 med 10 cysteinrester, och en grupp av tre GHz-defensiner, VkBD16, VkBD17 och VkBD18, med åtta cysteinrester.
de två domänerna för vkbd7 för skydd av bakterier är homologa med domänerna för vkbd8 för skydd av bakterier och orthologer i andra arter av Squamata. I anole ödla A. carolinensis finns det två orthologs, LzBD6 med en domän av typen Macau-defensin och den icke-klustret LzBD82 med två domäner av typen Macau-defensin. Orthologerna i ormar (SnBD5 och SnBD6) har en domän av typen Macau-defensin. VkBD34 är en ortolog av LzBD39 i anoler och SnBD15 i ormar. VkBD39 och VkBD43 består av tre respektive två homologa domäner för defensin, vilka är homologa med de tredje exonerna av lzbd52, LzBD53 och LzBD55, som alla har två icke-homologa domäner för defensin. VkBD40 med en domänen för försvar är homolog med de andra exonerna av LzBD52, LzBD53, LzBD54 (med en försvarsdomän) och LzBD55.
en ökning av antalet cysteiner i domänen för defensin resulterar i att eventuellt bilda ytterligare disulfidbroar. Exempel på denna variation kan hittas i psittacine Bisexuell-defensin, Psittaciforme AvBD12 . Vkbd6: s domän för försvars-och försvarsindustrin verkar bestå av 10 cysteiner, varav fyra ingår i en förlängning efter en typisk domän för försvars-och försvarsindustrin med ytterligare ett parat cystein (C-X6-C-X4-C-X9-C-X6-CC-X7-C-X7-CC-X5-C). Gruppen av Komodo Securities-defensins VkBD16, VkBD17 och VkBD18, förutom att ha ett atypiskt cysteinavstånd, har också åtta cysteiner inom ett typiskt antal rester. Den efter denna grupp, vkbd19, är en paralog av dessa tre gener; emellertid innehåller domänen för defensin de mer typiska sex cysteinresterna.
genstrukturerna för dessa Komodo-gener av typen Baccarat-defensin är föremål för bekräftelse med stödjande bevis. Det finns ett antal atypiska strukturelement i anole ödlor inklusive ytterligare exoner som inte är av typen oox-defensin eller större exoner.
analyser av peptidsekvenserna kodade av de nyligen identifierade Komodo dragon-defensin-generna avslöjade att majoriteten (53 av 66) av dem förutspås ha en nettopositiv laddning vid fysiologiska förhållanden, vilket är typiskt för denna klass av antimikrobiell peptid (tabell 3). Det är emellertid anmärkningsvärt att fyra peptider (VkBD10, VkBD28, VkBD30 och VkBD34) förutspås vara svagt katjoniska eller neutrala (+0,5–0) vid pH 7, medan nio peptider (VkBD3, VkBD4, VkBD11, VkBD19, VkBD23, VkBD26, VkBD35, VkBD36 och VkBD37) förutspås vara svagt till starkt anjoniska. Dessa fynd tyder på att även om dessa peptider uppvisar kanoniska strukturella egenskaper hos sackaros-defensin och är bosatta i kluster av genförsvars-genen, kan en eller flera av dessa gener inte koda för sackaros-defensinliknande peptider eller kanoniska sackaros-defensiner, eftersom sackaros-defensiner vanligtvis är katjoniska och deras positiva laddning bidrar till deras antimikrobiella aktivitet.
identifiering av Komodo dragon ovodefensin gener
Ovodefensin gener har hittats i flera fågel-och reptilarter , med uttryck som finns i äggvita och andra vävnader. Ovodefensiner inklusive kycklingpeptiden gallin (Gallus gallus OvoDA1) har visat sig ha antimikrobiell aktivitet mot den Gram-negativa E. coli och den Gram-positiva S. aureus. Presumptiva ovarie-ovodefensins finns i ett kluster i samma synteniska block som kluster av fåglar och reptiler. Det har funnits 19 äggdefensiner i A. carolinensis (en med en åtta cystein-defensindomän) och fem i ormar (fyra med en åtta cystein-defensindomän) (Prickett, MD, opublicerat pågående arbete). Komodo-drakklustret består av sex ovodefensins (Tabell 4 och 5). Två av dessa kan vara Komodo dragon specifika; VkOVOD1, som är en pseudois en ortholog av SnOVOD1 förutom den första Bisexuell-ovodefensin i sköldpaddor och krokodilians. Defensin-domänerna VkOVOD3, VkOVOD4 och VkOVOD6 består av åtta cysteiner, ortologer av SnOVOD2, SnOVOD3 respektive SnOVOD5. VkOVOD4 och VkOVOD6 är ortologer av LzOVOD14.
identifiering av Komodo dragon cathelicidin-generna
Cathelcidinpeptidgener har nyligen identifierats i reptiler genom genomikmetoder . Flera cathelicidinpeptidgener har identifierats i fåglar, ormar och anole ödla . Frisättningen av funktionella katelicidin antimikrobiella peptider har observerats från kyckling heterofiler, vilket tyder på att reptil heterofiler kan också vara en källa till dessa peptider . Alibardi et al. har identifierat katelicidinpeptider som uttrycks i anol ödla vävnader, inklusive associerade med heterofiler . Cathelicidin antimikrobiella peptider tros spela nyckelroller i medfödd immunitet hos andra djur och så sannolikt spela denna roll i Komodo draken samt.
i anole ödlor är katelicidingenklustret, bestående av 4 gener, organiserat enligt följande: <FASTK> katelicidinkluster <KLHL18>. Vi sökte efter ett liknande cathelicidinkluster i Komodo-drakgenomet. Genom att söka i Komodo-drakgenomet efter katelicidinliknande gener avslöjade ett kluster av tre gener som har en ”katelinliknande domän”, vilket är det första kravet på en katelicidingen, belägen i ena änden av saffold 84. Denna region av scaffold 84 har dock monteringsproblem med luckor, isolerade exoner och duplikationer. Identifierade Komodo dragon cathelicidin-gener har fått sitt namn efter deras anolorthologer. Två av Komodo dragon cathelicidins (Cathelicidin2 och Cathelicidin4.1) finns i sektioner utan monteringsproblem. Däremot konstruerades Cathlicidin4.2 med användning av en mångfaldig uppsättning exoner 1-3 och en felplacerad exon 4 för att skapa en komplett gen, som är paralog mot Cathelicidin4.1. Eftersom klustret finns i ena änden av ställningen kan det finnas ytterligare oidentifierade katelicidiner som inte fångas i denna montering.
en vanlig egenskap hos katelicidin antimikrobiella peptidgensekvenser är att den N-terminala katelindomänen kodar för minst 4 cysteiner. I vår studie av alligator och ormkatelicidiner noterade vi också att vanligtvis efter den sista cysteinen föregår ett tre-restmönster bestående av VRR eller liknande sekvens omedelbart den förutsagda C-terminala katjoniska antimikrobiella peptiden . Ytterligare krav på en katelicidin antimikrobiell peptidgensekvens är att den kodar för en nettopositiv laddad peptid i C-terminalregionen, den kodas vanligtvis av den fjärde exonen, och den är typiskt ungefär 35 aa i längd (intervall 25-37) . Eftersom det naturligt förekommande proteaset som är ansvarigt för klyvning och frisättning av de funktionella antimikrobiella peptiderna inte är känt är förutsägelse av den exakta klyvningsstället svårt. Som kan ses i Tabell 6 listas de förutsagda aminosyrasekvenserna för var och en av de identifierade Komodo dragon cathelicidin-genkandidaterna. Genom att utföra vår analys på varje sekvens gjorde vi förutsägelser och slutsatser om huruvida varje potentiell katelicidingen kan koda för en antimikrobiell peptid.
det kan ses att den förutsagda N-terminala proteinsekvensen av Cathelicidin2_VARKO (VK-CATH2) innehåller fyra cysteiner (understrukna, Tabell 6). Det finns emellertid inte en uppenbar ”VRR” eller liknande sekvens i ~ 10-aminosyrorna efter den sista cysteinresten som vi såg i alligatorn och relaterade katelicidinsekvenser . Dessutom avslöjar analys av de 35 C-terminala aminosyrorna en förutsagd peptidsekvens som saknar en nettopositiv laddning. Av dessa skäl förutspår vi att Katelicidin2_varko-gensekvensen inte kodar för en aktiv katelicidin antimikrobiell peptid vid dess C-terminal (Tabell 7).
för den identifierade Katelicidin4 .1_varko-genen innefattar den förutsagda katelindomänen de nödvändiga fyra cysteinresterna (Tabell 6), och sekvensen ”VTR” är närvarande inom 10 aminosyror från den sista cysteinen, liknande ”VRR” – sekvensen i alligatorkatelicidingenen. Den 33-aa C-terminala peptiden som följer” VTR ” – sekvensen förutses ha en netto + 12-laddning vid fysiologiskt pH, och en stor del av sekvensen förutses vara spiralformad , vilket överensstämmer med katelicidiner. Majoriteten av kända katelicidiner innehåller segment med betydande spiralstruktur . Slutligen indikerar analys av sekvensen med användning av den antimikrobiella Peptiddatabasen att peptiden potentiellt är en katjonisk antimikrobiell peptid . Därför förutspår vi att denna gen sannolikt kodar för en aktiv katelicidin antimikrobiell peptid, kallad VK-CATH4.1 (Tabell 7).
dessutom visar denna peptid viss homologi till andra kända antimikrobiella peptider i den antimikrobiella Peptiddatabasen (Tabell 8). Det visar en särskilt hög grad av sekvenslikhet med katelicidinpeptider identifierade från squamater, med exempel inkluderade i Tabell 8. Således har den förutspådda VK-CATH4.1-peptiden många av kännetecknen för en katelicidinpeptid och är en stark kandidat för vidare studier. Tabell 8 visar inriktningen av VK_CATH4 .1 med kända peptider i den antimikrobiella Peptiddatabasen.
för den identifierade Cathelicidin4.2_varko-genen inkluderar den förutsagda katelindomänen de nödvändiga fyra cysteinresterna (Tabell 6). Som noterats i Katelicidin4 .1_varko-genen är sekvensen ”VTR” närvarande inom 10 aminosyror i den fjärde cysteinresten och föregår omedelbart Det C-terminala segmentet, vilket kodar för en 30-aa-peptid som förutses vara antimikrobiell. Aminosyrasekvensen för den C-terminala peptiden förutses ha en netto + 10-laddning vid fysiologiskt pH, och det visar varierande grader av homologi till andra kända antimikrobiella peptider i den antimikrobiella Peptiddatabasen . Således, som VK-CATH4.1, uppvisar denna kandidatpeptid också många av kännetecknen för katelicidinpeptider och är en andra stark kandidat för vidare studier. Tabell 8 visar homologin och anpassningen av VK-CATH4.2 med kända peptider från den antimikrobiella Peptiddatabasen. Slutligen finns gensekvensen som kodar för den funktionella peptiden VK-CATH4.2 på exon 4, vilket är den typiska platsen för den aktiva katelicidinpeptiden. Denna exon kodar för peptidsekvensen LDRVTRRRRRFFQKAKRFVKRHGVSIAVGAYRIIG.
den förutsagda peptiden VK-CATH4.2 är mycket homolog med peptider från andra förutsagda katelicidingener, med liknande förutsagda C-terminala peptider, från A. carolinensis, G. japonicus och P. bivittatus (Tabell 8). Rester 2-27 av VK-CATH4.2 är 65% identiska och 80% liknar anolen Cathelicidin – 2 som förutsagd C-terminal peptid (XP_008116755.1, aa 130-155). Rester 2-30 av VK-CATH4.2 är 66% identiska och 82% liknar den gecko Cathelicidin-relaterade förutsagda C-terminala peptiden (XP_015277841.1, aa 129-151). Slutligen är aa 2-24 av VK-CATH4.2 57% identiska och 73% liknar den Katelicidinrelaterade OH-CATH-liknande förutsagda C-terminala peptiden (XP_007445036.1, aa 129-151).