Tipos celulares en sangre de dragón de Komodo
Se obtuvo una muestra de sangre de un dragón de Komodo llamado Tujah en el Parque Zoológico de la Granja de Caimanes de San Agustín de acuerdo con los procedimientos reglamentarios y de seguridad requeridos, y con las aprobaciones apropiadas. En el momento de la recolección, estábamos interesados en recopilar tanto ADN genómico para secuenciar como ARNm para generar una biblioteca de ADNc para facilitar nuestros estudios proteómicos. En las aves, se sabe que los heterófilos (glóbulos blancos) expresan múltiples péptidos antimicrobianos . Los péptidos antimicrobianos identificados a partir de heterófilos de pollo exhiben actividades inmunomoduladoras antimicrobianas y dirigidas al huésped significativas . En consecuencia, después de obtener una muestra inicial de sangre fresca de dragón de Komodo, permitimos que los glóbulos blancos se asentaran fuera de la sangre y los recolectamos porque era probable que estuvieran involucrados con la expresión de péptidos antimicrobianos. Los glóbulos blancos del dragón de Komodo recolectados se dividieron uniformemente, la mitad se procesó para el aislamiento del ADN genómico en preparación para la secuenciación y la generación de bibliotecas, y la otra mitad se reservó para la extracción de ARNm para nuestros estudios proteómicos.
Luego realizamos frotis e identificamos los diversos tipos de células que observamos. La identificación de células inmunitarias en sangre de dragón de Komodo es un desafío debido a la limitada literatura publicada como referencia. Los diversos tipos de células que se observaron en frotis de sangre teñidos con Wright se muestran en la Fig. 2. Identificamos estas células en base a la similitud con las células inmunitarias que habíamos identificado previamente en la sangre de cocodrilo americano . De interés fueron los glóbulos rojos nucleados grandes y alargados de este reptil. Además, pudimos identificar heterófilos (similares a los granulocitos), una fuente probable de péptidos de catelicidina, así como células de monocitos y linfocitos.
Glóbulos rojos del dragón de Komodo y células inmunitarias. Las células sanguíneas del dragón de Komodo se visualizaron mediante tinción de Wright y se tomaron imágenes a 40 veces. Los tipos de células se identifican como: A. glóbulos rojos nucleados, B. monocitos, C. linfocitos y D. heterófilos
Una segunda muestra de sangre de dragón de Komodo fue recolectada y procesada para extracción de ADN genómico por Genómica de cola de milano para secuenciación adicional. Los investigadores de Dovetail Genomics no separaron los glóbulos blancos, sino que extrajeron ADN de células granuladas directamente de sangre completa.
Ensamblaje y anotación del genoma del dragón de Komodo
Análisis previos de eritrocitos de dragón de Komodo utilizando citometría de flujo estimaron que el genoma tenía aproximadamente 1,93 Gb de tamaño . Utilizando la secuenciación profunda de Illumina y los enfoques de cola de milano, obtuvimos un ensamblaje de genoma preliminar de 1,60 Gb de tamaño, similar al tamaño del genoma del lagarto A. carolinensis, que es de 1,78 Gb . El proyecto de montaje contiene 67.605 andamios con N50 de 23,2 Mb (Tabla 1). Se predijeron un total de 17.213 genes, y se anotaron 16.757 (97,35%) de ellos. Las estimaciones de exhaustividad con CEGMA fueron del 56% («completo») y del 94% («parcial»). El porcentaje estimado de repeticiones en el genoma es del 35,05%, siendo la mayoría líneas (38,4%) y senos (5,56%) (Archivo adicional 1: Fig. S1 & Archivo adicional 2: Tabla S1). Los datos genómicos estarán disponibles en NCBI con lecturas de secuenciación sin procesar depositadas en el Archivo de Lectura de Secuencias (#SRP161190), y el ensamblaje del genoma en DDBJ/ENA/GenBank bajo el número de acceso VEXN00000000. La versión de ensamblaje descrita en este documento es VEXN01000000.
La identificación de la inmunidad innata potencial y los genes peptídicos antimicrobianos
La inmunidad innata en reptiles es un aspecto crítico de su éxito evolutivo, pero sigue siendo poco conocida en estos animales. La inmunidad innata se define como aquellos aspectos de la inmunidad que no son anticuerpos ni células T. Las respuestas inmunitarias innatas a los patógenos invasores pueden incluir la expresión de citoquinas, la activación y el reclutamiento de macrófagos, leucocitos y otros glóbulos blancos, y la expresión de péptidos antimicrobianos como las defensinas y las catelicidinas .
En este trabajo hemos adoptado un enfoque basado en la genómica para identificar genes de inmunidad innata en el genoma del dragón de Komodo. Hemos secuenciado el genoma de Komodo y lo hemos examinado en busca de genes y grupos de importantes genes peptídicos antimicrobianos de inmunidad innata (β-defensinas, ovodefensinas y catelicidinas), que probablemente estén involucrados en expresiones de inmunidad innata en este lagarto gigante.
β-Defensina y genes relacionados en el genoma de Komodo
Las defensinas son un ejemplo de péptidos antimicrobianos estabilizados con disulfuro, siendo las β-defensinas una familia única de vertebrados de péptidos antimicrobianos catiónicos estabilizados con disulfuro que participan en la resistencia a la colonización microbiana en superficies epiteliales . Los péptidos β-defensin se definen por un motivo característico de seis cisteína con espaciado de residuos de cisteína conservado (C-X6-C-X (3-5)–C–X (8-10)–C–X6-CC) y un patrón asociado de unión de disulfuro (Cys1-Cys5, Cys2-Cys4 y Cys3-Cys6); sin embargo, se han observado variaciones en el número de residuos de cisteína y el espaciado entre ellos. Al igual que con otros péptidos antimicrobianos catiónicos, las β-defensinas típicamente exhiben una carga positiva neta (catiónica, básica).
Uno de los primeros informes extensos de un papel in vivo para la expresión de péptidos β-defensina en reptiles es la expresión inducible de β-defensinas en lagartos anole heridos (Anolis carolinensis) . Los neutrófilos de reptiles parecen tener gránulos que contienen tanto péptidos similares a catelicidinas como péptidos β-defensin. los péptidos tipo β-defensin también se encuentran en huevos de reptiles . Es bien sabido que algunas especies de lagartos pueden perder sus colas como método de escape de depredadores, y que estas colas se regeneran desde el sitio de la herida sin inflamación o infección. los péptidos β-defensin se expresan tanto dentro de los granulocitos azurófilos en el lecho de la herida como en el epitelio asociado y se observan en los fagosomas que contienen bacterias degradadas. Hay una clara falta de inflamación en la herida, que está asociada con la regeneración, y dos β-defensinas en particular se expresan en niveles altos en los tejidos de curación En general, parece haber un papel significativo para las β-defensinas en la curación y regeneración de la herida en el lagarto anole .
se ha observado generalmente que los genes β-defensin residen en grupos dentro de los genomas de vertebrados . En humanos, se identificaron hasta 33 genes β-defensin en cinco grupos . Recientemente, los análisis de los genomas de varias especies de aves, incluidos el pato, el pinzón cebra y el pollo, revelaron que el genoma de cada especie contenía un grupo de β-defensin . Recientemente se ha identificado un grupo de genes tipo β-defensin en el lagarto anole (Dr. Prickett, trabajo inédito en progreso), que está estrechamente relacionado con el dragón de Komodo . Curiosamente, el gen de la catepsina B (CTSB) se ha identificado como un marcador fuerte para los grupos de β-defensina en humanos, ratones y pollos . Por lo tanto, examinamos el genoma de Komodo para el gen de la catepsina B (CTSB) como un marcador potencial para ayudar en la identificación del grupo(s) de β-defensina en el mismo.
A través de estos análisis, identificamos un total de 66 genes β-defensivos potenciales en el genoma del dragón de Komodo, de los cuales se cree que 18 son genes β-defensivos específicos del dragón de Komodo (Tabla 2). Los genes β-defensina identificados a partir del genoma del dragón de Komodo exhiben variaciones en el espaciado de cisteína, el tamaño del gen, el número de residuos de cisteína que componen el dominio β-defensina, así como el número de dominios β-defensina. Con respecto al espaciamiento de residuos de cisteína conservada, especialmente al final (C–X6–C–X (3-5)–C–X (8-10)–C–X6–CC), encontramos una variabilidad considerable en nuestro análisis de los genes β-defensivos en el genoma del dragón de Komodo, en el que cinco genes β-defensivos del dragón de Komodo tienen siete residencias entre las últimas cisteínas, 16 tienen seis residuos entre las últimas cisteínas, 42 tienen cinco residuos entre las últimas cisteínas y tres β-los genes de la defensin presentan patrones de espaciamiento entre cisteína y residuos más complejos (Tabla 2).
Al igual que con las aves y otros reptiles, la mayoría de los genes defensivos del dragón de Komodo parecen residir en dos grupos separados dentro del mismo bloque sintenico (Fig. 3). Un grupo es un grupo de β-ovodefensina flanqueado en un extremo por el gen de la familia relacionada con la subunidad del complejo de grupos sanguíneos Kell, miembro 6 (XKR6) y en el otro extremo por el gen de la proteína relacionada con la miotubularina 9 (MTMR9). La región intercluster de alrededor de 400.000 pb incluye los genes de la Familia con similitud de secuencia 167, miembro A (FAM167A); proto-oncogén BLK, tirosina quinasa de la familia Src (BLK); Farnesil-difosfato farnesil transferasa 1 (FDFT1); y CTSB (catepsina B), que es un gen que flanquea el cúmulo de β-defensina (Fig. 3). En aves, tortugas y cocodrilos, el otro extremo del grupo de β-defensin es seguido por el gen de la proteína de membrana asociada a la Translocación 2 (TRAM2). Como es el caso de todos los otros genomas escamados (lagartos y serpientes) estudiados, el gen que flanquea el extremo del cúmulo de β-defensina no puede determinarse definitivamente en la actualidad, ya que no hay genomas escamados con cúmulos intactos disponibles.
grupos de familias de genes β-defensin. Ubicaciones de andamios de los genes identificados de la defensin y la ovodefensina del dragón de Komodo, destacando los grupos de defensin y ovodefensina en el genoma del dragón de Komodo
El extremo del cúmulo podría estar flanqueado por XPO1, TRAM2 o ninguno de los dos. Dos de los tres genes encontrados en el andamio 45 con TRAM2 (VkBD80a, VkBD80b) son casi idénticos y potencialmente el resultado de un artefacto de ensamblaje. Los genes son ortólogos del gen final en los grupos de β-defensina de aves, tortugas y cocodrilos. El ortólogo anole para este gen está aislado y no está asociado con TRAM2, XPO1, ni ninguna otra β-defensina, y no hay β-defensinas encontradas en la proximidad de anole TRAM2. Dos de los siete genes asociados con XPO1 tienen ortólogos con uno de los cinco genes anole asociados con XPO1, pero no se puede determinar en ninguna de las especies si estos son parte del resto del grupo de β-defensin o parte de un grupo adicional. Los ortólogos de serpientes están asociados con TRAM2, pero no forman parte del grupo.
Diversidad estructural
La diversidad se puede ver en variaciones en la estructura del dominio β-defensin. Típicamente, una β-defensina consta de 2-3 exones: un péptido señal, un exón con el dominio propiedad y β-defensina con seis cisteínas, y en algunos casos, un tercer exón corto. Las variaciones en el número de dominios β-defensivos, el tamaño de los exones, el número de exones, el espaciamiento atípico de las cisteínas y/o el número de cisteínas en el dominio β-defensiva se pueden encontrar en todas las especies de reptiles estudiadas (sin publicar). Hay tres β-defensinas con dos dominios defensivos (VkBD7, VkBD34 y VkBD43) y una con tres dominios defensivos (VkBD39). Los genes β-defensin del dragón de Komodo VkBD12, VkBD13 y VkBD14 y sus ortólogos en anoles tienen exones atípicamente grandes. El grupo de β-defensinas entre VkBD16 y VkBD21 también tiene exones atípicamente grandes. El espaciamiento atípico entre los residuos de cisteína se encuentra en tres defensinas β, VkBD20 (1-3-9-7), VkBD57 (3-4-8-5) y VkBD79 (3-10-16-6). Hay cuatro β-defensinas con residuos adicionales de cisteína en el dominio β-defensina: VkBD6 con 10 residuos de cisteína, y un grupo de tres defensinas β, VkBD16, VkBD17 y VkBD18, con ocho residuos de cisteína.
Los dos dominios β-defensin de VkBD7 son homólogos al dominio β-defensin de VkBD8 con ortólogos en otras especies de Squamata. En el lagarto anole A. carolinensis hay dos ortólogos, LzBD6 con un dominio β-defensin y el no cluster LzBD82 con dos dominios β-defensin. Los ortólogos de las serpientes (SnBD5 y SnBD6) tienen un dominio β-defensin. VkBD34 es un ortólogo de LzBD39 en anoles y SnBD15 en serpientes. VkBD39 y VkBD43 constan de tres y dos dominios homólogos de β-defensina, respectivamente, que son homólogos de los terceros exones de LzBD52, LzBD53 y LzBD55, todos los cuales tienen dos dominios no homólogos de β-defensina. VkBD40 con un dominio β-defensin es homólogo a los segundos exones de LzBD52, LzBD53, LzBD54 (con un dominio defensin) y LzBD55.
Un aumento en el número de cisteínas en el dominio β-defensin da lugar posiblemente a la formación de puentes de disulfuro adicionales. Ejemplos de esta variación se pueden encontrar en la psitaciforme β-defensina, Psitaciforme AvBD12. El dominio β-defensin de VkBD6 parece consistir en 10 cisteínas, cuatro de las cuales son parte de una extensión después de un dominio β-defensin típico con una cisteína pareada adicional (C-X6-C-X4-C-X9-C-X6-CC-X7-C-X7-CC-X5-C). El grupo de β-defensinas de Komodo VkBD16, VkBD17 y VkBD18, además de tener un espaciado atípico de cisteína, también tiene ocho cisteínas dentro de un número típico de residuos. El β-defensin que sigue a este grupo, VkBD19, es un paralelismo de estos tres genes; sin embargo, el dominio β-defensin contiene los seis residuos de cisteína más típicos.
Las estructuras genéticas de estos genes β-defensin de Komodo están sujetas a confirmación con pruebas de apoyo. Hay una serie de elementos de estructura atípicos en los lagartos anoles, incluidos exones adicionales de dominio no β-defensin o exones más grandes.
Los análisis de las secuencias de péptidos codificadas por los genes β-defensin del dragón de Komodo recientemente identificados revelaron que se prevé que la mayoría (53 de 66) de ellos tengan una carga positiva neta en condiciones fisiológicas, como es típico para esta clase de péptidos antimicrobianos (Tabla 3). Sin embargo, es notable que se predice que cuatro péptidos (VkBD10, VkBD28, VkBD30 y VkBD34) sean débilmente catiónicos o neutros (+ 0,5–0) a pH 7, mientras que nueve péptidos (VkBD3, VkBD4, VkBD11, VkBD19, VkBD23, VkBD26, VkBD35, VkBD36 y VkBD37) se predice que son de débil a fuertemente aniónicos. Estos hallazgos sugieren que, si bien estos péptidos exhiben características estructurales canónicas de β-defensina y residen en grupos de genes de β-defensina, uno o más de estos genes pueden no codificar péptidos similares a β-defensina o β-defensinas canónicas, porque las β-defensinas típicamente son catiónicas y su carga positiva contribuye a su actividad antimicrobiana.
Identificación de genes de ovodefensina de dragón de Komodo
Se han encontrado genes de ovodefensina en múltiples especies de aves y reptiles , con expresión en clara de huevo y otros tejidos. Se ha demostrado que las ovodefensinas, incluido el péptido de pollo gallina (Gallus gallus OvoDA1), tienen actividad antimicrobiana contra la E. coli Gram negativa y la S. aureus Gram positiva. Las presuntas β-ovodefensinas se encuentran en un grupo en el mismo bloque sintenico que el grupo β-defensin en aves y reptiles. Se han encontrado 19 β-ovodefensinas en A. carolinensis (una con un dominio de ocho cisteína β-defensiva) y cinco en serpientes (cuatro con un dominio de ocho cisteína β-defensiva) (Dr. Prickett, trabajo inédito en progreso). El cúmulo de dragones de Komodo consta de seis β-ovodefensinas (Tablas 4 y 5). Dos de ellos pueden ser específicos del dragón de Komodo; VkOVOD1, que es un pseudónimo de SnOVOD1, además de la primera β-ovodefensina en tortugas y cocodrilos. Los dominios defensin VkOVOD3, VkOVOD4 y VkOVOD6 consisten en ocho cisteínas, ortólogos de SnOVOD2, SnOVOD3 y SnOVOD5, respectivamente. VkOVOD4 y VkOVOD6 son ortólogos de LzOVOD14.
Identificación de los genes de catelicidina del dragón de Komodo
Recientemente se han identificado genes de péptidos de catelcidina en reptiles a través de enfoques genómicos . Se han identificado varios genes péptidos de catelicidina en aves , serpientes y lagartijas anole . Se ha observado la liberación de péptidos antimicrobianos catelicidinos funcionales a partir de heterófilos de pollo, lo que sugiere que los heterófilos de reptiles también pueden ser una fuente de estos péptidos . Alibardi et al. han identificado péptidos de catelicidina que se expresan en tejidos de lagarto anole, incluso asociados con heterófilos . Se cree que los péptidos antimicrobianos de catelicidina desempeñan un papel clave en la inmunidad innata en otros animales y, por lo tanto, es probable que también desempeñen este papel en el dragón de Komodo.
En los lagartos anoles, el grupo de genes de catelicidina, que consta de 4 genes, se organiza de la siguiente manera: <FASTK> grupo de catelicidina <KLHL18>. Buscamos un cúmulo de catelicidinas similar en el genoma del dragón de Komodo. La búsqueda del genoma del dragón de Komodo en busca de genes similares a la catelicidina reveló un grupo de tres genes que tienen un «dominio similar a la catelina», que es el primer requisito de un gen de catelicidina, ubicado en un extremo de saffold 84. Sin embargo, esta región del andamio 84 tiene problemas de ensamblaje con huecos, exones aislados y duplicaciones. Los genes catelicidinos identificados del dragón de Komodo han sido nombrados por sus ortólogos anoles. Dos de las catelicidinas del dragón de Komodo (Catelicidina 2 y Catelicidina 4.1) están en secciones sin problemas de ensamblaje. Por el contrario, la catlicidina 4.2 se construyó utilizando un conjunto diverso de exones 1-3 y un exón 4 fuera de lugar para crear un gen completo, que es paralelo a la Catelicidina4.1. Como el racimo se encuentra en un extremo del armazón, puede haber catelicidinas no identificadas adicionales que no se capturan en este conjunto.
Una característica común de las secuencias génicas de péptidos antimicrobianos de catelicidina es que el dominio de catelina N-terminal codifica para al menos 4 cisteínas. En nuestro estudio de catelicidinas de cocodrilo y serpiente, también observamos que, por lo general, después de la última cisteína, un patrón de tres residuos que consiste en VRR o una secuencia similar precede inmediatamente al péptido antimicrobiano catiónico terminal previsto . Los requisitos adicionales de una secuencia génica de péptidos antimicrobianos de catelicidina son que codifica para un péptido cargado neto positivo en la región C-terminal, típicamente está codificado por el cuarto exón, y es típicamente de aproximadamente 35 aa de longitud (rango 25-37) . Dado que no se conoce la proteasa natural responsable de la escisión y la liberación de los péptidos antimicrobianos funcionales, es difícil predecir el lugar exacto de la escisión. Como se puede ver en la Tabla 6, se enumeran las secuencias de aminoácidos previstas para cada uno de los candidatos a gen catelicidina del dragón de Komodo identificados. Al realizar nuestro análisis de cada secuencia, hicimos predicciones y conclusiones sobre si cada gen de catelicidina potencial puede codificarse para un péptido antimicrobiano.
Se puede observar que la secuencia de proteína N-terminal prevista de Catelicidin2_varko (VK-CATH2) contiene cuatro cisteínas (subrayadas, Tabla 6). Sin embargo, no hay una secuencia obvia de «VRR» o similar en los ~ 10 aminoácidos que siguen al último residuo de cisteína como vimos en las secuencias de cocodrilo y catelicidina relacionadas . Además, el análisis de los 35 aminoácidos C-terminales revela una secuencia de péptidos predicha que carece de una carga positiva neta. Por estas razones, predecimos que la secuencia del gen Catelicidin2_varko no codifica para un péptido antimicrobiano catelicidino activo en su terminal C (Tabla 7).
Para el gen Catelicidina 4.1_VARKO identificado, el dominio catelina predicho incluye los cuatro residuos de cisteína necesarios (Tabla 6), y la secuencia «VTR» está presente en 10 aminoácidos de la última cisteína, similar a la secuencia «VRR» en el gen catelicidina de cocodrilo . Se predice que el péptido C-terminal de 33 aa que sigue a la secuencia «VTR» tendrá una carga neta de + 12 a pH fisiológico, y se predice que una gran parte de la secuencia será helicoidal , lo que es consistente con las catelicidinas. La mayoría de las catelicidinas conocidas contienen segmentos con una estructura helicoidal significativa . Finalmente, el análisis de la secuencia utilizando la Base de Datos de péptidos antimicrobianos indica que el péptido es potencialmente un péptido antimicrobiano catiónico . Por lo tanto, predecimos que este gen probablemente codifica para un péptido antimicrobiano catelicidina activo, llamado VK-CATH4.1 (Tabla 7).
Además, este péptido demuestra cierta homología con otros péptidos antimicrobianos conocidos en la Base de datos de péptidos Antimicrobianos (Tabla 8). Muestra un grado particularmente alto de similitud de secuencias con los péptidos catelicidinos identificados a partir de escamatos, con ejemplos incluidos en la Tabla 8. Por lo tanto, el péptido VK-CATH4.1 predicho tiene muchas de las características distintivas de un péptido de catelicidina y es un fuerte candidato para estudios posteriores. La Tabla 8 muestra la alineación de VK_CATH4 .1 con péptidos conocidos en la Base de Datos de Péptidos Antimicrobianos.
Para el gen Catelicidina 4.2_VARKO identificado, el dominio de catelina previsto incluye los cuatro residuos de cisteína necesarios (Tabla 6). Como se observó en el gen Catelicidina 4.1_VARKO, la secuencia «VTR» está presente en 10 aminoácidos del cuarto residuo de cisteína, e inmediatamente precede al segmento C-terminal, que codifica para un péptido 30-aa que se predice que es antimicrobiano. Se prevé que la secuencia de aminoácidos del péptido C-terminal tenga una carga neta de + 10 a pH fisiológico, y demuestra diversos grados de homología a otros péptidos antimicrobianos conocidos en la Base de Datos de péptidos antimicrobianos . Por lo tanto, al igual que VK-CATH4.1, este péptido candidato también exhibe muchas de las características distintivas asociadas con los péptidos de catelicidina, y es un segundo candidato fuerte para estudios posteriores. La Tabla 8 muestra la homología y alineación de VK-CATH4.2 con péptidos conocidos de la Base de Datos de Péptidos Antimicrobianos. Finalmente, la secuencia génica que codifica el péptido funcional VK-CATH4.2 se encuentra en el exón 4, que es la ubicación típica del péptido catelicidina activo. Este exón codifica la secuencia de péptidos LDRVTRRRWRRFFQKAKRFVKRHGVSIAVGAYRIIG.
El péptido predicho VK-CATH4.2 es altamente homólogo con péptidos de otros genes catelicidinos predichos, con péptidos C-terminales similares predichos, de A. carolinensis, G. japonicus y P. bivittatus (Tabla 8). Residuos 2-27 de CATH4 VK.2 son 65% idénticos y 80% similares a la catelicidina anolar-2 como el péptido C-terminal predicho (XP_008116755.1, aa 130-155). Los residuos 2-30 de VK-CATH4.2 son 66% idénticos y 82% similares al péptido C-terminal predicho relacionado con catelicidina de geco (XP_015277841.1, aa 129-151). Finalmente, el aa 2-24 de VK-CATH4. 2 es 57% idéntico y 73% similar al péptido C-terminal predicho similar al OH-CATH relacionado con la catelicidina (XP_007445036.1, aa 129-151).